Τροποποίηση των Παραρτημάτων ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV, V, VΙ και VΙΙ του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214) «Μέτρα για τον έλεγχο του παθογόνου βακτηρίου των γεωμήλων και της ντομάτας Ralstοnia sοlanacearum (Smith) Υabuuchi et al. σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 98/57/ΕΚ του Συμβουλίου.», σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 2006/63/ΕΚ της Επιτροπής και συμπλήρωση διατάξεων του διατάγματος αυτού.

loading...

Φόρτωση περιεχομένων ...


Εμφάνιση ολόκληρου του εγγράφου 

Άρθρο 1 "Σκοπός"
1.  
    Με το παρόν προεδρικό διάταγμα αντικαθίστανται τα Παραρτήματα ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV, V, VΙ και VΙΙ του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214), σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 2006/63/ΕΚ (L 206/36, 27.7.2006) της Επιτροπής «για την τροποποίηση των παραρτημάτων ΙΙ έως VΙΙ της Οδηγίας 98/57/ΕΚ του Συμβουλίου για τον έλεγχο του Ralstοnia sοlanacearum (Smith) Υabuuchi et al.» και συμπληρώνονται διατάξεις του διατάγματος αυτού.
Άρθρο 2
1.  
(άρθρο 1 Οδηγίας 2006/63/ΕΚ)Τα Παραρτήματα ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV, V, VΙ και VΙΙ του άρθρου 11 του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214) αντικαθίστανται αντίστοιχα ως εξής : «ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΣΧΗΜΑ ΔΟΚΙΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ, ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ RΑLSΤΟΝΙΑ SΟLΑΝΑCΕΑRUΜ (SΜΙΤΗ) ΥΑΒUUCΗΙ ΕΤ ΑL. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΗΣ Στο παρόν σχήμα περιγράφονται οι διάφορες διαδικασίες για: i) τη διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πατάτας και της βακτηριακής μάρανσης σε φυτά πατάτας και τομάτας καθώς και σε άλλα φυτά ξενιστές· ii) την ανίχνευση του Ralstοnia sοlanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας, φυτών πατάτας, τομάτας και άλλων φυτών ξενιστών, στο νερό και το έδαφος· iii) την ταυτοποίηση του Ralstοnia sοlanacearum (R. sοlanacearum). ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ Στα Προσαρτήματα παρέχονται βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα σχετικά με τις διάφορες μεθόδους, επικυρωμένα (νalidated) αντιδραστήρια και λεπτομέρειες για την προετοιμασία των υλικών δοκιμής και μαρτύρων. Στο Προσάρτημα 1 παρατίθεται κατάλογος των εργαστηρίων που συμμετείχαν στη βελτιστοποίηση και επικύρωση των πρωτοκόλλων. Λόγω του ότι τα πρωτόκολλα αφορούν την ανίχνευση ενός οργανισμού καραντίνας και περιλαμβάνουν τη χρήση βιώσιμων καλλιεργειών του R. sοlanacearum ως υλικών μαρτύρων, είναι απαραίτητο να εφαρμοσθούν οι διαδικασίες υπό τις κατάλληλες συνθήκες καραντίνας, με επαρκείς εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων και υπό την προϋπόθεση προηγούμενης χορήγησης των κατάλληλων αδειών από τις αρμόδιες αρχές που είναι υπεύθυνες για θέματα καραντίνας φυτών. Οι παράμετροι που καθορίζουν τη διεξαγωγή των δοκιμών πρέπει να εξασφαλίζουν σταθερή και αναπαραγώγιμη ανίχνευση των επιπέδων του R. sοlanacearum στα καθορισθέντα όρια των επιλεγμένων μεθόδων. Η ακριβής παρασκευή των θετικών μαρτύρων είναι επιτακτική. Η διενέργεια δοκιμών σύμφωνα με τα απαιτούμενα όρια προϋποθέτει επίσης την εξασφάλιση ορθών παραμέτρων, συντήρηση και βαθμονόμηση του εξοπλισμού, την προσεκτική μεταχείριση και συντήρηση των αντιδραστηρίων καθώς και τη λήψη όλων των απαραίτητων μέτρων για την αποφυγή μόλυνσης μεταξύ των δειγμάτων, π.χ. το διαχωρισμό των θετικών μαρτύρων από τα ελεγχόμενα δείγματα. Είναι απαραίτητο να εφαρμόζονται πρότυπα ελέγχου της ποιότητας έτσι ώστε να αποφεύγονται διοικητικά και άλλα σφάλματα, ιδιαίτερα όσον αφορά την σήμανση και την τεκμηρίωση. Η πιθανολογούμενη εμφάνιση του παθογόνου, όπως αυτή αναφέρεται στο άρθρο 4 παράγραφος 2 του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214), σημαίνει την ύπαρξη θετικού αποτελέσματος των διαγνωστικών δοκιμών ή των δοκιμών διαλογής που διενεργήθηκαν επί δείγματος, όπως ορίζεται στα διαγράμματα ροής που παρατίθενται στη συνέχεια. Μία θετική πρώτη δοκιμή διαλογής (δοκιμή ΙF, ΡCR/FΙSΗ, εκλεκτική απομόνωση) πρέπει να επιβεβαιωθεί από δεύτερη δοκιμή διαλογής με βάση διαφορετική βιολογική αρχή. Εάν η πρώτη δοκιμή διαλογής είναι θετική, η μόλυνση από το R. sοlanacearum θεωρείται πιθανή και πρέπει να πραγματοποιηθεί δεύτερη δοκιμή διαλογής. Εάν και η δεύτερη δοκιμή διαλογής είναι θετική, η υποψία μόλυνσης επιβεβαιώνεται (πιθανολογούμενη εμφάνιση του παθογόνου) και πρέπει να συνεχισθεί η πραγματοποίηση δοκιμών σύμφωνα με το σχήμα. Εάν η δεύτερη δοκιμή διαλογής είναι αρνητική, τότε θεωρείται ότι το δείγμα δεν έχει μολυνθεί από το R. sοlanacearum. Η επιβεβαίωση της παρουσίας του οργανισμού, όπως αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 1 του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214), σημαίνει την απομόνωση και ταυτοποίηση καθαρής καλλιέργειας του R. sοlanacearum και επιβεβαίωση της παθογένειας. ΕΝΟΤΗΤΑ Ι ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΩΝ 1.Σχήμα ανίχνευσης για τη διάγνωση της καστανής σήψης και της βακτηριακής μάρανσης (Ralstοnia sοlanacearum) σε κονδύλους πατάτας και φυτά πατάτας, τομάτας ή άλλα φυτά ξενιστές που παρουσιάζουν συμπτώματα καστανής σήψης ή βακτηριακής μάρανσης. Η διαδικασία εξέτασης προορίζεται για κονδύλους και φυτά πατάτας που παρουσιάζουν τυπικά ή ύποπτα συμπτώματα της καστανής σήψης ή μαρασμού των φυτών. Η διαδικασία περιλαμβάνει μία δοκιμή ταχείας διαλογής, απομόνωση του παθογόνου αιτίου από μολυσμένο αγγειώδη ιστό σε (εκλεκτικά) υλικά και, σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, ταυτοποίηση της καλλιέργειας ως Ralstοnia sοlanacearum. 2.Σχήμα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstοnia sοlanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών κονδύλων πατάτας Αρχή:Η διαδικασία εξέτασης αποσκοπεί στην ανίχνευση μολύνσεων σε λανθάνουσα μορφή σε κονδύλους πατάτας. Το θετικό αποτέλεσμα τουλάχιστον δύο δοκιμών διαλογής(3) που βασίζεται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές, πρέπει να συμπληρώνεται με την απομόνωση του παθογόνου· ακολουθεί δε, στην περίπτωση απομόνωσης τυπικών αποικιών, επιβεβαίωση μιας καθαρής καλλιέργειας ως καλλιέργειας R. sοlanacearum. Το θετικό αποτέλεσμα μίας μόνον δοκιμής διαλογής δεν επαρκεί για να θεωρηθεί το δείγμα ύποπτο. Οι δοκιμές διαλογής και οι δοκιμές απομόνωσης πρέπει να επιτρέπουν την ανίχνευση 103 έως 104 κυττάρων/ml αιωρήματος του ιζήματος, συμπεριλαμβανομένων ως θετικών μαρτύρων σε κάθε σειρά δοκιμών. 3.Σχήμα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstοnia sοlanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων φυτών ξενιστών Ενότητα ΙΙ Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση του Ralstοnia sοlanacearum σε κονδύλους πατάτας και σε φυτά πατάτας, τομάτας Ή άλλα φυτά ξενιστές που παρουσιάζουν συμπτώματα καστανησ σήψης ή βακτηριακής μάρανσης 1.Συμπτώματα (βλέπε ιστοχώρο http:1.1. Συμπτώματα στην πατάτα Στο φυτό πατάτας. Το αρχικό στάδιο της μόλυνσης στον αγρό αναγνωρίζεται από τον μαρασμό των φύλλων προς την κορυφή του φυτού σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της ημέρας με ανάληψη κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στα αρχικά στάδια της μάρανσης τα φύλλα παραμένουν πράσινα, αλλά αργότερα αναπτύσσεται κίτρινη και καστανή νέκρωση. Παρουσιάζεται επίσης επιναστία. Η μάρανση ενός βλαστού ή ολόκληρων των φυτών σύντομα καθίσταται μη αναστρέψιμη και έχει ως αποτέλεσμα την κατάρρευση και το θάνατο του φυτού. Ο αγγειώδης ιστός σε εγκαρσίως κομμένα στελέχη από μαραμένα φυτά συνήθως εμφανίζεται καστανός, και μία γαλακτώδης βακτηριακή εξίδρωση εκρέει από την κομμένη επιφάνεια, ή μπορεί να εξέλθει με συμπίεση. Όταν ένα κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, από τις αγγειώδεις δέσμες εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού. Στον κόνδυλο πατάτας. Οι κόνδυλοι πρέπει να κόβονται εγκαρσίως κοντά στο σημείο πρόσφυσης του στολονίου είτε κατά μήκος πάνω από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου. Το αρχικό στάδιο της ασθένειας αναγνωρίζεται από έναν υαλώδη κίτρινο προς ανοικτό καστανό, μεταχρωματισμό του αγγειώδους δακτυλίου από τον οποίο εκρέει αυθόρμητα μετά λίγα λεπτά ένα υπόλευκο βακτηριακό εξίδρωμα. Αργότερα, ο αγγειακός μεταχρωματισμός καθίσταται εντονότερα καστανός και η νέκρωση μπορεί να επεκταθεί στον παρεγχυματικό ιστό. Σε προχωρημένα στάδια της ασθένειας, η μόλυνση εκδηλώνεται εξωτερικά από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και τους οφθαλμούς από τους οποίους μπορεί να εκρέει βακτηριακό γλοιώδες έκκριμα προκαλώντας την προσκόλληση σωματιδίων του εδάφους. Ενδέχεται να εμφανίζονται στην επιδερμίδα ερυθροκάστανες, ελαφρώς βυθισμένες κηλίδες λόγω της εσωτερικής κατάρρευσης των αγγειωδών ιστών. Η δευτερογενής ανάπτυξη μαλακών σήψεων από μύκητες ή βακτήρια είναι συχνή στα προχωρημένα στάδια της ασθένειας. 1.2. Συμπτώματα στην τομάτα Στο φυτό τομάτας. Το πρώτο ορατό σύμπτωμα είναι η έλλειψη σπαργής στα νεαρά φύλλα. Υπό περιβαλλοντικές συνθήκες που είναι ευνοϊκές για το παθογόνο (θερμοκρασία εδάφους περίπου 25°C, ατμόσφαιρα κορεσμένη σε υγρασία), μέσα σε λίγες μέρες εμφανίζεται επιναστία και μαρασμός της μιας πλευράς ή και ολόκληρου του φυτού, στη συνέχεια δε πλήρης κατάρρευση του φυτού. Υπό λιγότερο ευνοϊκές συνθήκες (θερμοκρασία εδάφους κάτω των 21°C), ο μαρασμός είναι λιγότερος αλλά μπορεί να αναπτύσσεται μεγάλος αριθμός τυχαίων ριζών επί του στελέχους. Είναι δυνατόν να παρατηρούνται βρεγμένες λωρίδες από τη βάση του στελέχους πράγμα που αποτελεί απόδειξη της νέκρωσης του αγγειακού συστήματος. Σε εγκάρσιες τομές του στελέχους, από τους καστανόχρωμα μεταχρωματισμένους αγγειακούς ιστούς εκρέει λευκή ή υποκίτρινη βακτηριακή εξίδρωση. 1.3. Συμπτώματα σε άλλους ξενιστές Φυτά Sοlanum dulcamara και S. nigrum. Σε φυσικές συνθήκες, σπανίως παρατηρούνται συμπτώματα μάρανσης στα εν λόγω ζιζάνια–ξενιστές, εκτός εάν οι θερμοκρασίες του εδάφους υπερβαίνουν τους 25°C ή τα επίπεδα του μολύσματος είναι εξαιρετικά υψηλά (π.χ. για το S. nigrum που αναπτύσσεται δίπλα σε προσβεβλημένα φυτά πατάτας ή τομάτας). Όταν εμφανίζεται μάρανση, τα συμπτώματα που παρατηρούνται είναι όμοια με αυτά που περιγράφονται για την τομάτα. Φυτά S. dulcamara που δεν έχουν υποστεί μαρασμό και τα οποία αναπτύσσονται με τα στελέχη και τις ρίζες σε νερό, ενδέχεται να εμφανίζουν απαλό καστανό εσωτερικό μεταχρωματισμό του αγγειώδους ιστού σε εγκάρσια τομή της βάσης του στελέχους ή τμημάτων του στελέχους κάτω από το νερό. Ενδέχεται να εκρέει βακτηριακή εξίδρωση από κομμένους αγγειώδεις ιστούς ή να εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού εάν το κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, ακόμη και εάν δεν υπάρχουν συμπτώματα μάρανσης. 2.Δοκιμές ταχείας διαλογής Οι δοκιμές ταχείας διαλογής είναι δυνατόν να διευκολύνουν την προκαταρκτική διάγνωση αλλά δεν είναι απόλυτα αναγκαίες. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες επικυρωμένες δοκιμές: 2.1. Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος (Βλέπε ενότητα VΙ.Α.1.) 2.2. Ανίχνευση πολυ-β-υδροξυβουτυρικών (ΡΗΒ) κοκκίων Τα χαρακτηριστικά κοκκία ΡΗΒ στα κύτταρα του R. sοlanacearum καθίστανται ορατά διά χρώσεως λεπτών επιχρισμάτων (που έχουν προσηλωθεί με θερμότητα) βακτηριακού εξιδρώματος από προσβεβλημένο ιστό σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου με Νile Βlue Α ή Sudan Βlack (βλέπε ενότητα VΙ.Α.2.). 2.3. Δοκιμές οροσυγκόλλησης (Βλέπε ενότητα VΙ.Α.3.) 2.4. Άλλες δοκιμές Στις περαιτέρω κατάλληλες δοκιμές ταχείας διαλογής συμπεριλαμβάνεται η δοκιμή ΙF (βλέπε ενότητα VΙ.Α.5.), η δοκιμή FΙSΗ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.7.), οι δοκιμές ΕLΙSΑ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.8.) και οι δοκιμές ΡCR (βλέπε ενότητα VΙ.Α.6). 3.Διαδικασία απομόνωσης 1)Λαμβάνεται εξίδρωμα ή τμήματα μεταχρωματισμένου ιστού από τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου πατάτας ή τις αγγειώδεις δέσμες του στελέχους πατάτας, τομάτας ή άλλων μαραμένων φυτών ξενιστών. Παρασκευάζεται αιώρημα των ανωτέρω σε μικρό όγκο αποστειρωμένου αποσταγμένου νερού ή σε 50 mΜ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (προσάρτημα 4) και το αιώρημα αφήνεται για 5-10 λεπτά. 2)Παρασκευάζουμε μία σειρά δεκαδικών αραιώσεων του αιωρήματος. 3)Μεταφέρουμε 50-100 µl του αιωρήματος και των αραιώσεων σε γενικής χρήσεως θρεπτικό υπόστρωμα (ΝΑ, ΥΡGΑ ή SΡΑ·βλέπε προσάρτημα 2) ή/και σε υλικό του Κelman με τετραζόλιο (προσάρτημα 2) ή/και σε επικυρωμένο εκλεκτικό υπόστρωμα (π.χ. SΜSΑ, βλέπε προσάρτημα 2). Απλώνονται ή εξαπλώνονται γραμμωτά με κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος. Αν θεωρηθεί χρήσιμο, παρασκευάζονται ξεχωριστά τρυβλία με αραιωμένο αιώρημα κυττάρων του Ralstοnia sοlanacearum βιοποικιλίας 2 που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας. 4)Τα τρυβλία επωάζονται για 2-6 ημέρες στους 28 °C. - Στα γενικής χρήσεως θρεπτικά υποστρώματα, οι παθογόνες απομονώσεις R. sοlanacearum αναπτύσσουν μαργαριταρώδους χροιάς υπόλευκες, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίες που εμφανίζουν συχνά χαρακτηριστικές σπείρες στο κέντρο. Οι μη παθογόνες απομονώσεις του R. sοlanacearum σχηματίζουν μικρές στρογγυλές μη ρευστώδεις, βουτυρώδεις αποικίες που έχουν εντελώς κρεμ-λευκό χρώμα. - Στο υπόστρωμα Κelman με tetrazοlium και στο υπόστρωμα SΜSΑ, οι ελικώσεις είναι αιματέρυθρες. Οι μη παθογόνες απομονώσεις του Ralstοnia sοlanacearum σχηματίζουν μικρές στρογγυλές μη ρευστώδεις, βουτυρώδεις αποικίες που έχουν εντελώς βαθυκόκκινο χρώμα. 4.Δοκιμές ταυτοποίησης του R. sοlanacearum Οι δοκιμές για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των πιθανών απομονώσεων του R. sοlanacearum παρουσιάζονται στην ενότητα VΙ.Β. ΕΝΟΤΗΤΑ ΙΙΙ 1.Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstοnia sοlanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών κονδύλων πατάτας 1.1. Προετοιμασία του δείγματος Σημείωση:? Το τυπικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι ανά δοκιμή. Για πιο εντατική δειγματοληψία απαιτούνται περισσότερες δοκιμές σε δείγματα του μεγέθους αυτού. Τυχόν μεγαλύτεροι αριθμοί κονδύλων στο δείγμα θα έχει ως αποτέλεσμα παρεμπόδιση ή δυσκολίες στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η διαδικασία όμως μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των 200 κονδύλων στην περίπτωση που είναι λιγότεροι οι διαθέσιμοι κόνδυλοι. ? Η επικύρωση όλων των μεθόδων ανίχνευσης που περιγράφονται στη συνέχεια βασίζεται στη διενέργεια δοκιμών σε δείγματα 200 κονδύλων. ? Το εκχύλισμα πατάτας που περιγράφεται παρακάτω μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του βακτηρίου της δακτυλιωτής σήψης της πατάτας, Claνibacter michiganensis subsp. sepedοnicus. Προαιρετική προεπεξεργασία πριν από την προετοιμασία του δείγματος: 1)Τα δείγματα επωάζονται στους 25-30 °C για διάστημα μέχρι 2 εβδομάδων πριν από τη διενέργεια των δοκιμών για την ενθάρρυνση του πολλαπλασιασμού τυχόν πληθυσμών του R. sοlanacearum. 2)Πλένονται οι κόνδυλοι. Χρησιμοποιούνται κατάλληλα απολυμαντικά (χλωριούχες ενώσεις εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή ΡCR με στόχο την απομάκρυνση τυχόν DΝΑ του παθογόνου) και απορρυπαντικά μετά από κάθε δείγμα. Οι κόνδυλοι στεγνώνουν στον αέρα. Η ανωτέρω διαδικασία πλύσης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για δείγματα που περιβάλλονται από υπερβολικό χώμα καθώς και στην περίπτωση που πρόκειται να εφαρμοσθεί η δοκιμή ΡCR ή η διαδικασία άμεσης απομόνωσης, αλλά δεν είναι υποχρεωτική. 1.1.1. Με ένα καθαρό και απολυμασμένο νυστέρι ή ειδικό μαχαίρι λαχανικών, αφαιρείται η επιδερμίδα γύρω από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου του κονδύλου έτσι ώστε να φανούν οι αγγειώδεις ιστοί. Αποκόπτουμε με προσοχή ένα μικρό κώνο αγγειώδους ιστού από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και προσέχουμε ώστε η αφαιρούμενη ποσότητα μη αγγειώδους ιστού να είναι η ελάχιστη δυνατή. (βλέπε ιστοχώρο http:Σημείωση: Κάθε κόνδυλος (με σήψη) που παρουσιάζει ύποπτα συμπτώματα της ασθένειας αφήνεται παράμερα και εξετάζεται χωριστά. Εάν κατά τη διάρκεια της αφαίρεσης του κώνου από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου παρατηρηθούν ύποπτα συμπτώματα καστανής σήψη,ς θα πρέπει να διενεργηθεί μακροσκοπική επιθεώρηση του κονδύλου και να κοπεί ο κόνδυλος αυτός κοντά στο σημείο πρόσφυσης του στολονίου. Όλοι οι κομμένοι κόνδυλοι με ύποπτα συμπτώματα πρέπει να διατηρούνται για 2 τουλάχιστον ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η φελλοποίηση και στη συνέχεια να φυλάσσονται στο ψυγείο (4 – 10 °C) υπό τις κατάλληλες συνθήκες καραντίνας. Όλοι οι κόνδυλοι, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που παρουσιάζουν ύποπτα συμπτώματα,, πρέπει να διατηρούνται σύμφωνα με όσα προβλέπονται στο παράρτημα ΙΙΙ. 1.1.2. Οι κώνοι που έχουν ληφθεί από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου συλλέγονται σε μη χρησιμοποιηθέντες περιέκτες μίας χρήσης, οι οποίοι είναι δυνατόν να είναι κλεισμένοι ή/και σφραγισμένοι (στην περίπτωση που οι περιέκτες έχουν ξαναχρησιμοποιηθεί θα πρέπει να καθαρισθούν επιμελώς και να απολυμανθούν με χλωριούχες ενώσεις). Είναι προτιμότερο να υποβάλλονται οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου σε κατεργασία αμέσως. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, αποθηκεύονται στον περιέκτη, χωρίς την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος, στο ψυγείο για 72 ώρες το ανώτατο ή σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες το ανώτατο. Οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: 1)Οι κώνοι καλύπτονται με επαρκή όγκο (περίπου 40 ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4) και αναταρράσσονται σε περιστροφικό αναδευτήρα (50-100 rpm) για 4 ώρες σε θερμοκρασία χαμηλότερη των 24 °C ή για 16-24 ώρες στο ψυγείο. 2)Οι κώνοι ομοιογενοποιούνται με επαρκή όγκο (περίπου 40 ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4), είτε σε αναμείκτη (π.χ. Waring ή Ultra Τhurax) είτε με σύνθλιψη σε σφραγισμένο σάκο διαβροχής μίας χρήσης (π.χ. Stοmacher ή Βiοreba strοng guage pοlythene, 150 mm x 250 mm· αποστειρωμένο διά ακτινοβολίας) χρησιμοποιώντας λαστιχένια ματσόλα ή τον κατάλληλο εξοπλισμό σύνθλιψης(π.χ. Ηοmex). Σημείωση: Ο κίνδυνος επιμόλυνσης των δειγμάτων είναι υψηλός όταν τα δείγματα έχουν ομοιογενοποιηθεί με τη χρήση αναμείκτη. Πρέπει να ληφθούν προφυλάξεις για την αποφυγή της δημιουργίας αερολύματος ή υπερχείλισης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εξαγωγής. Πρέπει να εξασφαλισθεί ότι για κάθε δείγμα οι λεπίδες και τα δοχεία του αναμεικτήρα αποστειρώνονται λίγο πριν την έναρξη της διαδικασίας. Εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή ΡCR, πρέπει να αποφευχθεί η μεταφορά DΝΑ στους περιέκτες ή τον εξοπλισμό σύνθλιψης. Στις περιπτώσεις που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η ΡCR, συνιστάται η σύνθλιψη σε σάκους μίας χρήσης καθώς και η χρήση σωλήνων μίας χρήσης. 1.1.3.Το υπερκείμενο υγρό μεταγγίζεται. Εάν το υγρό εμφανίζεται υπερβολικά θολό, καθίσταται διαυγές είτε με φυγοκέντριση σε χαμηλή ταχύτητα (όχι περισσότερο από 180 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 4-10°C) είτε με διήθηση (40-100 µm) με αντλία κενού, πλένοντας το φίλτρο με πρόσθετο (περίπου 10 ml) ρυθμιστικό διάλυμα εξαγωγής. 1.1.4. Το βακτηριακό κλάσμα συγκεντρώνεται με φυγοκέντριση σε 7.000 g για 15 λεπτά (ή 10.000 g για 10 λεπτά) σε θερμοκρασία 4-10 °C και το υπερκείμενο υγρό απορρίπτεται χωρίς να διαταραχθεί το ίζημα. 1.1.5. Το ίζημα αναδιαλύεται σε 1,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4). Χρησιμοποιούνται 500 µl για το R. sοlanacearum, 500 µl για το Claνibacter michiganensis subsp. sepedοnicus και 500 µl για σκοπούς αναφοράς. Προστίθεται αποστειρωμένη γλυκερίνη σε τελική συγκέντρωση 10-25% (ν/ν) στα 500 µl της κατάλληλης ποσότητας αναφοράς και στην εναπομείνασα κατάλληλη ποσότητα δοκιμής, ανακατεύουμε με στροβιλισμό (νοrtex) και αποθηκεύουμε στους ?16 έως -24 °C (εβδομάδες) ή στους -68 έως -86 C (μήνες). Οι ποσότητες δοκιμών διατηρούνται σε θερμοκρασία 4-10 °C κατά τη διεξαγωγή των δοκιμών. Δεν συνιστάται η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη. Εάν απαιτείται η μεταφορά του εκχυλίσματος, πρέπει να εξασφαλισθεί ότι η διανομή θα πραγματοποιηθεί σε ψυκτικό δοχείο εντός 24 έως 48 ωρών. 1.1.6. Είναι επιτακτικό όπως όλοι οι θετικοί μάρτυρες του R. sοlanacearum και τα δείγματα κατεργάζονται χωριστά, ώστε να αποφεύγεται η επιμόλυνση. Το ίδιο ισχύει και για τις αντικειμενοφόρους της δοκιμής ΙF και για όλες τις δοκιμές. 1.2. Διενέργεια δοκιμών Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των δοκιμών και των βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων στα σχετικά προσαρτήματα: Εκλεκτική απομόνωση (βλέπε ενότητα VΙ.Α.4.) Δοκιμή ΙF (βλέπε ενότητα VΙ.Α.5) Δοκιμές ΡCR (βλέπε ενότητα VΙ.Α.6.) Δοκιμή FΙSΗ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.7.) Δοκιμές ΕLΙSΑ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.8.) Βιοδοκιμή (βλέπε ενότητα VΙ.Α.9.) 2.Λεπτομερείς μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. sοlanacearum σε δείγματα ασυμπτωματικών φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων φυτών ξενιστών 2.1. Προετοιμασία του δείγματος Σημείωση: Για την ανίχνευση των λανθανόντων πληθυσμών του R. sοlanacearum συνιστάται ο έλεγχος σύνθετων δειγμάτων. Η διαδικασία είναι δυνατόν να εφαρμοσθεί κατάλληλα και για σύνθετα δείγματα με έως 200 τμήματα στελεχών. Εάν πραγματοποιούνται επισκοπήσεις, αυτές πρέπει να βασίζονται σε στατιστικά αντιπροσωπευτικό δείγμα του πληθυσμού φυτών υπό εξέταση. 2.1.1.Τα τμήματα στελεχών 1-2 cm συλλέγονται σε κλειστό αποστειρωμένο περιέκτη σύμφωνα με τις ακόλουθες διαδικασίες δειγματοληψίας: Σπορόφυτα τομάτας φυτωρίου: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι, αφαιρείται τμήμα 1 cm από τη βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το έδαφος. Φυτά τομάτας που έχουν αναπτυχθεί στον αγρό ή σε θερμοκήπιο: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι, απομακρύνουμε το χαμηλότερο πλευρικό βλαστό από κάθε φυτό κόβοντας ακριβώς πάνω από το σημείο ένωσης με το κύριο στέλεχος. Απομακρύνουμε το χαμηλότερο τμήμα ενός εκατοστού από κάθε πλευρικό βλαστό. Άλλοι ξενιστές: Με ένα καθαρό και απολυμασμένο μαχαίρι ή κλαδευτική ψαλίδα, αφαιρείται τμήμα 1 cm από τη βάση κάθε στελέχους, πάνω ακριβώς από το έδαφος. Στην περίπτωση του S. dulcamara ή άλλων φυτών ξενιστών που αναπτύσσονται στο νερό, αφαιρούμε τμήματα (1-2 cm) από τα στελέχη ή στολόνια που βρίσκονται κάτω από το νερό και τα οποία έχουν αναπτύξει ρίζες μέσα στο νερό. Όταν πραγματοποιείται δειγματοληψία σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία, συνιστάται η εξέταση στατιστικά αντιπροσωπευτικού δείγματος τουλάχιστον 10 φυτών ανά σημείο δειγματοληψίας κάθε πιθανού ζιζάνιου – ξενιστή. Η ανίχνευση του παθογόνου είναι περισσότερο αξιόπιστη κατά τα τέλη της άνοιξης, το καλοκαίρι και το φθινόπωρο, αν και οι φυσικές μολύνσεις είναι δυνατόν να ανιχνευθούν καθ’ όλη τη διάρκεια του έτους στο πολυετές φυτό Sοlanum dulcamara που αναπτύσσεται στα υδατορεύματα. Γνωστοί ξενιστές είναι τα φυτά εθελοντές της πατάτας, το Sοlanum dulcamara, το S. nigrum, το Datura stramοnium και άλλα είδη της οικογένειας των σολανωδών (Sοlanaceae). Άλλοι ξενιστές είναι το Ρelargοnium spp. και το Ροrtulaca οleracea. Ορισμένα ευρωπαϊκά είδη ζιζανίων, τα οποία δύνανται ενδεχομένως να φιλοξενούν πληθυσμούς R. sοlanacearum βιοποικιλίας 2, φυλής 3 στις ρίζες ή/και τις ριζόσφαιρες υπό ειδικές περιβαλλοντικές συνθήκες είναι τα Αtriplex hastata, Βidens pilοsa, Cerastium glοmeratum, Chenοpοdium album, Εupatοrium cannabinum, Galinsοga parνiflοra, Ranunculus scleratus, Rοrippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Τussilagο farfarra και Urtica diοica. Σημείωση: Στο στάδιο αυτό μπορεί να γίνει μακροσκοπική εξέταση για εσωτερικά συμπτώματα (χρώση του αγγειώδους ιστού ή βακτηριακό εξίδρωμα). Αφήνουμε παράμερα όλα τα τμήματα στελεχών που παρουσιάζουν συμπτώματα και τα εξετάζουμε ξεχωριστά (βλέπε ενότητα ΙΙ). 2.1.2. Τα τμήματα στελεχών απολυμαίνονται για σύντομο χρονικό διάστημα με αιθανόλη 70% και στεγνώνονται αμέσως με απορροφητικό χαρτί. Ακολούθως τα τμήματα στελεχών υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: είτε, 1)Τα τμήματα καλύπτονται με επαρκή όγκο (περίπου 40 ml) ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4) και αναταρράσσονται σε περιστροφικό αναδευτήρα (50-100 rpm) για 4 ώρες σε θερμοκρασία χαμηλότερη των 24 °C ή για 16-24 ώρες στο ψυγείο ή 2)Υποβάλλονται σε κατεργασία αμέσως με σύνθλιψη των τμημάτων εντός ανθεκτικού σάκκου διαβροχής (π.χ. Stοmacher ή Βiοreba) με τον κατάλληλο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4) χρησιμοποιώντας λαστιχένια ματσόλα ή τον κατάλληλο εξοπλισμό σύνθλιψης (π.χ. Ηοmex). Στην περίπτωση που αυτό δεν είναι δυνατόν, τα τμήματα στελέχους αποθηκεύονται στο ψυγείο για χρονικό διάστημα 72 ωρών το μέγιστο ή σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 24 ωρών το μέγιστο. 2.1.3. Το υπερκείμενο υγρό μεταγγίζεται αφού κατακαθίσει για 15 λεπτά. 2.1.4. Περαιτέρω διαύγαση του εκχυλίσματος ή της συγκέντρωσης του βακτηριακού κλάσματος δεν απαιτείται συνήθως αλλά είναι δυνατόν να επιτευχθεί με διήθηση ή/και φυγοκέντριση όπως περιγράφεται στην ενότητα ΙΙΙ.1.1.3 – 1.1.5. 2.1.5. Το αδιάλυτο ή συγκεντρωμένο εκχύλισμα δείγματος χωρίζεται σε 2 ίσα μέρη. Το ήμισυ διατηρείται σε 4-10 °C κατά τη διεξαγωγή της δοκιμής και το άλλο μισό φυλάσσεται με 10-25% (ν/ν) αποστειρωμένη γλυκερίνη σε θερμοκρασία –16 έως –24°C (εβδομάδες) ή σε θερμοκρασία –68 έως –86 C (μήνες) για την περίπτωση που χρειασθεί η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών. 2.2. Διενέργεια δοκιμών Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των δοκιμών και των βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων στα σχετικά προσαρτήματα: Εκλεκτική απομόνωση (βλέπε ενότητα VΙ.Α.4.) Δοκιμή ΙF (βλέπε ενότητα VΙ.Α.5) Δοκιμές ΡCR (βλέπε ενότητα VΙ.Α.6.) Δοκιμή FΙSΗ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.7.) Δοκιμές ΕLΙSΑ (βλέπε ενότητα VΙ.Α.8.) Βιοδοκιμή (βλέπε ενότητα VΙ.Α.9.) 2.Μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. sοlanacearum στο νερό ΑρχήΤο επικυρωμένο σχήμα ανίχνευσης που περιγράφεται στην ενότητα αυτή, εφαρμόζεται για την ανίχνευση του παθογόνου σε δείγματα επιφανειακών υδάτων και μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί για την εξέταση δειγμάτων λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων. Είναι σημαντικό, ωστόσο, να σημειωθεί ότι η αναμενόμενη ευαισθησία της ανίχνευσης θα ποικίλλει ανάλογα με το υπόστρωμα. Η ευαισθησία της δοκιμής απομόνωσης επηρεάζεται από τους πληθυσμούς των ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων που είναι συνήθως κατά πολύ περισσότεροι στα λύματα κατεργασίας πατάτας και ακάθαρτων υδάτων απ’ ό,τι στα επιφανειακά ύδατα. Ενώ το σχήμα που ακολουθεί αναμένεται να ανιχνεύσει τόσο λίγα όσο 103 κύτταρα ανά λίτρο σε επιφανειακά ύδατα, η ευαισθησία ανίχνευσης σε λύματα κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων είναι πιθανόν να είναι κατά πολύ μικρότερη. Για το λόγο αυτό, συνιστάται η εξέταση λυμάτων μετά από κάθε εργασία καθαρισμού (π.χ. καθίζηση ή διήθηση) κατά την οποία μειώνονται οι πληθυσμοί των σαπροφυτικών βακτηρίων. Οι περιορισμοί όσον αφορά την ευαισθησία του σχήματος δοκιμών πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την αξιολόγηση της αξιοπιστίας οιωνδήποτε αρνητικών αποτελεσμάτων. Παρά το γεγονός ότι το εν λόγω σχήμα έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε εργασίες επισκόπησης για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή απουσίας του παθογόνου σε επιφανειακά ύδατα, οι περιορισμοί που το συνοδεύουν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν χρησιμοποιείται σε παρόμοιες επισκοπήσεις λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων. 2.1. Προετοιμασία του δείγματος Σημείωση:- Η ανίχνευση του R. sοlanacearum σε επιφανειακά ύδατα είναι πιο αξιόπιστη κατά τα τέλη της άνοιξης, το καλοκαίρι και το φθινόπωρο όταν η θερμοκρασία του ύδατος υπερβαίνει τους 15 °C. - Η επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά την προαναφερθείσα χρονική περίοδο σε προσδιορισθέντα σημεία δειγματοληψίας θα ενισχύσει την αξιοπιστία της ανίχνευσης μειώνοντας τις επιδράσεις των κλιματικών μεταβολών. - Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις των ισχυρών βροχοπτώσεων και της γεωγραφίας των υδάτινων ρευμάτων έτσι ώστε να αποφεύγονται τα αποτελέσματα μεγάλης αραιώσεως που ενδέχεται να καταστήσουν ασαφή την παρουσία του παθογόνου. - Πρέπει να λαμβάνονται δείγματα επιφανειακών υδάτων που βρίσκονται κοντά σε φυτά ξενιστές εάν τα εν λόγω φυτά υπάρχουν. 2.1.1. Σε επιλεγμένα σημεία δειγματοληψίας, συλλέγουμε δείγματα νερού γεμίζοντας αποστειρωμένους σωλήνες ή φιάλες μίας χρήσεως, εάν είναι δυνατόν, σε βάθος κάτω των 30 cm και εντός αποστάσεως 2 m από την όχθη. Όσον αφορά τα λύματα κατεργασίας και ακάθαρτων υδάτων, συλλέγουμε δείγματα από το σημείο εκροής των λυμάτων. Συνιστώνται μεγέθη δειγμάτων έως 500 ml ανά σημείο δειγματοληψίας. Εάν προτιμώνται μικρότερα δείγματα, συνιστάται η λήψη δειγμάτων σε τουλάχιστον 3 περιπτώσεις ανά σημείο δειγματοληψίας, και κάθε δείγμα να αποτελείται από 2 επαναληπτικά υπο-δείγματα τουλάχιστον των 30 ml. Για εντατική εργασία επισκόπησης, επιλέγουμε τουλάχιστον 3 σημεία δειγματοληψίας ανά 3 χλμ υδάτινου ρεύματος και εξασφαλίζουμε ότι διενεργείται δειγματοληψία και στους παραπόταμους που εισέρχονται στο υδάτινο ρεύμα. 2.1.2. Τα δείγματα μεταφέρονται σε συνθήκες ψύχους και σκότους (4-10 °C) και εξετάζονται εντός 24 ωρών. 2.1.3. Εάν είναι απαραίτητο, το βακτηριακό κλάσμα μπορεί να συγκεντρωθεί χρησιμοποιώντας μία από τις ακόλουθες μεθόδους: 1)Τα υπο-δείγματα των 30-50 ml φυγοκεντρούνται σε 10.000 g για 10 λεπτά (ή 7.000 g για 15 λεπτά) κατά προτίμηση στους 4-10 °C, απορρίπτεται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4). 2)Διήθηση από μεμβράνη (ελάχιστο μέγεθος πόρων 0,45 µm) ακολουθούμενη από πλύση του φίλτρου σε 5-10 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος και παρακράτηση των εκπλυμάτων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται για μεγαλύτερους όγκους νερού που περιέχουν μικρότερους αριθμούς σαπροφύτων. Η συγκέντρωση δεν συνιστάται συνήθως για δείγματα λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή ακάθαρτων υδάτων καθώς αυξημένοι πληθυσμοί ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων θα παρεμποδίζουν την ανίχνευση του Ralstοnia sοlanacearum. 2.2. Διενέργεια δοκιμών Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των δοκιμών στα σχετικά προσαρτήματα. Μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. sοlanacearum στο έδαφος ΑρχέςΤο επικυρωμένο σχήμα ανίχνευσης που περιγράφεται στην ενότητα αυτή ισχύει για την ανίχνευση του παθογόνου σε δείγματα εδάφους αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης για τη δοκιμή δειγμάτων στερεών αποβλήτων κατεργασίας πατάτας ή ιλύος επεξεργασίας λυμάτων. Θα πρέπει, ωστόσο, να σημειωθεί ότι οι εν λόγω μέθοδοι δεν διαθέτουν επαρκή ευαισθησία έτσι ώστε να εγγυηθούν την ανίχνευση χαμηλών ή/και ακανόνιστα διασκορπισμένων πληθυσμών του Ralstοnia sοlanacearum που είναι δυνατόν να υπάρχουν σε φυσικώς μολυσμένα δείγματα των εν λόγω υποστρωμάτων. Οι περιορισμοί του εν λόγω σχήματος δοκιμής όσον αφορά την ευαισθησία πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την αξιολόγηση της αξιοπιστίας τυχόν αρνητικών αποτελεσμάτων καθώς επίσης και όταν χρησιμοποιούνται σε επισκοπήσεις για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή απουσίας του παθογόνου στο έδαφος ή την ιλύ. Η πιο αξιόπιστη δοκιμή για την ανίχνευση της παρουσίας του παθογόνου στο έδαφος ενός αγρού είναι η φύτευση ευπαθούς ξενιστή και η παρακολούθησή του όσον αφορά το ενδεχόμενο μόλυνσης, αλλά ακόμη και με τη μέθοδο αυτή τα χαμηλά επίπεδα μόλυνσης θα διαφύγουν την ανίχνευση. 2.1. Προετοιμασία του δείγματος 2.1.1. Η δειγματοληψία εδάφους στον αγρό θα πρέπει να διενεργείται σύμφωνα με τις τυποποιημένες αρχές της δειγματοληψίας για νηματώδεις. Συλλέγουμε 0,5 - 1 kg εδάφους ανά δείγμα από 60 θέσεις ανά 0,3 ha από βάθος 10-20 cm (ή σε επιφάνεια 7x7 μέτρων). Εάν υπάρχουν υπόνοιες για την παρουσία του παθογόνου, αυξάνουμε τον αριθμό σημείων συλλογής σε 120 ανά 0,3 ha. Διατηρούμε τα δείγματα στους 12-15 °C πριν από τη διενέργεια των δοκιμών. Η δειγματοληψία ιλύος κατεργασίας πατάτας ή λυμάτων πραγματοποιείται με τη συλλογή συνολικά 1 kg από τοποθεσίες που αντιστοιχούν στο συνολικό όγκο της ιλύος προς εξέταση. Αναμειγνύουμε καλά κάθε δείγμα πριν από τη διενέργεια δοκιμής. 2.1.2. Διασκορπίζουμε υπο-δείγματα των 10 – 25 g εδάφους ή ιλύος με περιστροφική ανάδευση (250 rpm) σε 60–150 ml ρυθμιστικού διαλύματος εξαγωγής (προσάρτημα 4) για μέγιστο χρονικό διάστημα 2 ωρών. Εάν είναι απαραίτητο, η προσθήκη 0,02% αποστειρωμένου Τween-20 και 10 - 20 g αποστειρωμένου σκύρου μπορεί να ενισχύσει το διασκορπισμό. 2.1.3. Το αιώρημα διατηρείται στους 4 °C κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής της δοκιμής. 2.2. Διενέργεια δοκιμών Βλέπε το διάγραμμα ροής και την περιγραφή των δοκιμών στα σχετικά προσαρτήματα. ΕΝΟΤΗΤΑ VΙ Βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του R. sοlanacearum Α. Δοκιμές διάγνωσης και ανίχνευσης 1.Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος Η παρουσία του R. sοlanacearum σε στελέχη μαραμένων φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων ξενιστών μπορεί να εκτιμηθεί με την ακόλουθη απλή προκαταρκτική δοκιμή: Κόβουμε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος. Αναρτάται η κομμένη επιφάνεια μέσα σε σωλήνα με καθαρό νερό. Παρατηρούμε εάν σε λίγα λεπτά παρουσιαστεί η χαρακτηριστική αυθόρμητη ροή βακτηριακού γλοιώδους εκκρίματος με τη μορφή κλωστών από τις κομμένες αγγειώδεις δέσμες. 2.Ανίχνευση πολυ-β-υδροξυβουτυρικών κοκκίων 1.Παρασκευάζουμε επίχρισμα της βακτηριακής εξίδρωσης από τους μολυσμένους ιστούς ή από 48ωρη καλλιέργεια σε υλικό ΥΡGΑ ή SΡΑ (προσάρτημα 2) σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου. 2.Παρασκευάζουμε επίσης επιχρίσματα θετικού μάρτυρα από στέλεχος του R. sοlanacearum βιοποικιλίας 2 και, αν θεωρηθεί χρήσιμο, ένα επίχρισμα αρνητικού μάρτυρα ενός είδους γνωστού ως αρνητικού στην παραγωγή ΡΗΒ. 3.Αφήνουμε να ξηρανθούν και περνούμε την κατώτερη επιφάνεια κάθε αντικειμενοφόρου γρήγορα πάνω από φλόγα για να προσηλωθούν τα επιχρίσματα. 4.Ακολουθεί χρώση του παρασκευάσματος με Νile Βlue ή Sudan Βlack και εξετάζονται στο μικροσκόπιο ως εξής: Δοκιμή Νile Βlue 1)Κάθε αντικειμενοφόρος καλύπτεται πλήρως με 1% υδατικό διάλυμα Νile Βlue Α και επωάζεται για 10 λεπτά στους 55 °C. 2)Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως. Πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης. Απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί. 3)Περιλούζουμε το επίχρισμα με 8% υδατικό διάλυμα οξικού οξέος και το αφήνουμε για επώαση επί 1 λεπτό σε θερμοκρασία εργαστηρίου. 4)Πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης. Απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί. 5)Ξαναρίχνουμε μία σταγόνα νερό και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα. 6)Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα με μικροσκόπιο επιφθορισμού στα 450 nm με ελαιοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 600-1000 χρησιμοποιώντας ένα έλαιο- ή υδατοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό. 7)Παρατηρούμε για την παρουσία κοκκίων ΡΗΒ με λαμπρό πορτοκαλί φθορισμό. Επίσης παρατηρούμε με κανονικό διερχόμενο φως για, να εξασφαλιστεί ότι τα κοκκία είναι ενδοκυτταρικά και ότι η μορφολογία των κυττάρων είναι η τυπική του R. sοlanacearum. Δοκιμή Sudan Βlack: 1)Κάθε αντικειμενοφόρος καλύπτεται πλήρως με 0,3% διάλυμα Sudan Βlack Β σε 70% αιθανόλη και επωάζεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου. 2)Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί. 3)Οι αντικειμενοφόροι βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε ξυλόλη και στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί. Προσοχή: Η ξυλόλη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να λαμβάνουμε τις απαραίτητες προφυλάξεις ασφαλείας και να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία. 4)Περιλούζουμε τις αντικειμενοφόρους με 0,5% (β/ο) υδατικό διάλυμα σαφρανίνης και το αφήνουμε για 10 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία εργαστηρίου. Προσοχή: Η σαφρανίνη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να λαμβάνουμε τις απαραίτητες προφυλάξεις ασφαλείας και να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία. 5)Ξεπλένουμε ήπια με ρέον νερό της βρύσης, στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα. 6)Εξετάζουμε τα χρωσμένα επιχρίσματα σε φωτομικροσκόπιο χρησιμοποιώντας διερχόμενο φως με ελαιοκαταδυτικό φακό και με κλίμακα μεγέθυνσης 1000 χρησιμοποιώντας ένα ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό. 7)Παρατηρούμε για κοκκία ΡΗΒ που έχουν χρωσθεί μπλε-μαύρα μέσα σε κύτταρα του R. sοlanacearum με χρωσμένα ροζ κυτταρικά τοιχώματα. 3.Δοκιμές οροσυγκόλλησης Η συγκόλληση των κυττάρων του R. sοlanacearum σε βακτηριακή εξίδρωση ή εκχυλίσματα ιστών που παρουσιάζουν συμπτώματα παρατηρείται καλύτερα με τη χρήση επικυρωμένων αντισωμάτων (βλέπε παράρτημα 3) επισημασμένων με τους κατάλληλους χρωματικούς δείκτες, όπως κόκκινα κύτταρα Staphylοcοccus aureus ή χρωσμένα σωματίδια latex. Εάν χρησιμοποιείται συσκευασία που διατίθεται στο εμπόριο (βλέπε προσάρτημα 3), ακολουθούμε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε διαφορετική περίπτωση, ακολουθείται η εξής διαδικασία: 1)Αναμειγνύουμε σταγόνες ενός αιωρήματος επισημασμένου αντισώματος και βακτηριακής εξίδρωσης (περίπου 5 µl το καθένα) σε φατνία πολυφατνιακών αντικειμενοφόρων δοκιμής. 2)Παρασκευάζουμε θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες χρησιμοποιώντας αιωρήματα του R. sοlanacearum βιοποικιλίας 2 και ετερόλογου στελέχους. 3)Παρατηρούμε εάν υπάρχει συγκόλληση σε θετικά δείγματα μετά από ελαφρά ανάμειξη για 15 δευτερόλεπτα. 4.Εκλεκτική απομόνωση 4.1. Εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματος Σημείωση: Προτού χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά τη μέθοδο αυτή, πρέπει να πραγματοποιήσετε προκαταρκτικές δοκιμές έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων που σχηματίζουν αποικίες του R. sοlanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα από δείγματα που προηγουμένως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Χρησιμοποιείστε ένα κατάλληλο επικυρωμένο εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα όπως το SΜSΑ (όπως τροποποιήθηκε από τον Εlphinstοne et al., 1996· βλέπε προσάρτημα 2). Χρειάζεται επίσης προσοχή ώστε το R. sοlanacearum να διαφοροποιείται από τυχόν άλλα βακτήρια που μπορεί να αναπτύξουν αποικίες στο θρεπτικό υπόστρωμα. Επιπροσθέτως, οι αποικίες του R. sοlanacearum ενδέχεται να παρουσιάζουν μη τυπική μορφολογία εάν τα τρυβλία έχουν υπερβολικούς πληθυσμούς του βακτηρίου ή υπάρχουν επίσης ανταγωνιστικά βακτήρια. Στις περιπτώσεις που υπάρχουν υπόνοιες για φαινόμενα ανταγωνισμού, το δείγμα πρέπει να επανεξετάζεται με διαφορετική δοκιμή. Είναι δυνατόν να αναμένεται η ύψιστη ευαισθησία ανίχνευσης με τη μέθοδο αυτή όταν χρησιμοποιούνται εκχυλίσματα δειγμάτων που έχουν μόλις παρασκευασθεί. Ωστόσο, η μέθοδος εφαρμόζεται επίσης για εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους - 68 έως -86 °C. Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις από αιώρημα 106 cfu ανά ml παθογόνου στελέχους του R. sοlanacearum βιοποικιλίας 2 (π.χ. ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857). Για την αποφυγή ενδεχόμενης μόλυνσης, παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες πλήρως διαχωρισμένοι από τα δείγματα προς δοκιμή. Η καταλληλότητα κάθε νέας παρτίδας εκλεκτικού υποστρώματος όσον αφορά την ανάπτυξη του παθογόνου πρέπει να ελέγχεται πριν χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των συνήθων δειγμάτων. Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. 4.1.1. Πραγματοποιείται η κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος με στόχο να εξασφαλισθεί ότι αραιώνονται οποιοιδήποτε πληθυσμοί σαπροφύτων που σχηματίζουν αποικίες. Απλώνονται 50 - 100 µl ανά τρυβλίο εκχυλίσματος δείγματος και κάθε αραίωση. 4.1.2. Τα τρυβλία επωάζονται στους 28 °C. Γίνεται ανάγνωση των τρυβλίων μετά από 48 ώρες και στη συνέχεια κάθε μέρα για 6 ημέρες. Οι τυπικές αποικίες του R. sοlanacearum σε θρεπτικό υπόστρωμα SΜSΑ είναι γαλακτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις και μετά από επώαση 3 ημερών αναπτύσσουν ρόδινο έως αιματέρυθρο χρώμα στο κέντρο με εσωτερικές ραβδώσεις ή ελικώσεις. (βλέπε http:Σημείωση: Ορισμένες φορές στο εν λόγω θρεπτικό υπόστρωμα σχηματίζονται μη τυπικές αποικίες του R. sοlanacearum. Οι αποικίες αυτές ενδέχεται να είναι μικρές, στρογγυλές, εντελώς κόκκινες στο χρώμα και μη ρευστώδεις ή μόνον μερικώς ρευστώδεις και, για το λόγο αυτό, είναι δύσκολο να τις ξεχωρίσει κανείς από σαπροφυτικά βακτήρια που σχηματίζουν αποικίες. 4.1.3. Καθαρίζονται οι πιθανές αποικίες του R. sοlanacearum ύστερα από γραμμωτή εξάπλωση ή εξάπλωση διαδοχικών αραιώσεων σε τρυβλία σε γενικής χρήσης θρεπτικό υλικό για την επίτευξη απομονωμένων αποικιών (βλέπε προσάρτημα 2). 4.1.4. Οι καλλιέργειες αποθηκεύονται για βραχέα διαστήματα σε αποστειρωμένο νερό (pΗ 6-8, χωρίς χλώριο) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι ή για μακρά διαστήματα σε κατάλληλο κρυοπροστατευτικό υλικό στους -68 έως -86 °C ή λυοφιλιωμένες. 4.1.5. Ταυτοποιούνται οι πιθανές καλλιέργειες (βλέπε ενότητα VΙ.Β.) και πραγματοποιείται δοκιμή παθογένειας (βλέπε ενότητα VΙ.Γ). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος Η δοκιμή αυτή είναι αρνητική εάν δεν παρατηρηθούν βακτηριακές αποικίες μετά από 6 ημέρες ή δεν εντοπισθούν πιθανές τυπικές αποικίες του R. sοlanacearum, υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν υπόνοιες για παρεμπόδιση λόγω ανταγωνισμού από άλλα βακτήρια και ότι στους θετικούς μάρτυρες έχουν βρεθεί τυπικές αποικίες R. sοlanacearum. Η δοκιμή είναι θετική εάν απομονωθούν πιθανές αποικίες του R. sοlanacearum. 4.2. Διαδικασία εμπλουτισμού Χρησιμοποιούμε ένα επικυρωμένο υπόστρωμα εμπλουτισμού όπως ο τροποποιημένος ζωμός Wilbrink (βλέπε προσάρτημα 2). Η διαδικασία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκλεκτική αύξηση των πληθυσμών του R. sοlanacearum σε εκχυλίσματα δειγμάτων και για την ενίσχυση της ευαισθησίας ανίχνευσης. Η εν λόγω διαδικασία, αραιώνει επίσης αποτελεσματικά παρεμποδιστές της αντίδρασης ΡCR (1:100). Θα πρέπει, ωστόσο, να σημειωθεί ότι ο εμπλουτισμός του R. sοlanacearum μπορεί να αποτύχει λόγω ανταγωνισμού από σαπροφυτικούς οργανισμούς οι οποίοι επίσης εμπλουτίζονται ταυτόχρονα. Για το λόγο αυτό, η απομόνωση του R. sοlanacearum από εμπλουτισμένες καλλιέργειες ζωμού ενδέχεται να είναι δύσκολη. Επιπροσθέτως, καθώς μπορεί να αυξηθούν οι πληθυσμοί ορολογικά σχετιζομένων βακτηρίων, συνιστάται η χρήση εξειδικευμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων αντί πολυκλωνικών αντισωμάτων όσον αφορά τις περιπτώσεις που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή ΕLΙSΑ. 4.2.1. Όσον αφορά την ΡCR εμπλουτισμού, μεταφέρουμε 100 µl εκχυλίσματος δείγματος σε 10 ml ζωμού εμπλουτισμού (προσάρτημα 2) που έχει προηγουμένως τοποθετηθεί σε επιμέρους ίσες ποσότητες σε σωλήνες ή φιάλες απαλλαγμένες από DΝΑ. Για την ΕLΙSΑ εμπλουτισμού, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν μεγαλύτερες αναλογίες εκχυλίσματος δείγματος σε σχέση με το ζωμό (π.χ. 100 µl σε 1,0 ml ζωμού εμπλουτισμού). 4.2.2. Επωάζουμε για 72 ώρες στους 27 έως 30 °C σε ανακινούμενη ή στατική καλλιέργεια διατηρώντας το καπάκι προσαρμοσμένο χαλαρά έτσι ώστε να είναι δυνατός ο αερισμός. 4.2.3. Αναμειγνύουμε καλά πριν από τη διεξαγωγή των δοκιμών ΕLΙSΑ ή ΡCR. 4.2.4. Επεξεργαζόμαστε τον εμπλουτισμένο ζωμό με τον ίδιο τρόπο όπως το (τα) δείγμα(-τα) στις ανωτέρω δοκιμές. Σημείωση: Εάν αναμένουμε παρεμπόδιση του εμπλουτισμού του R. sοlanacearum λόγω των υψηλών πληθυσμών ορισμένων ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων, είναι δυνατόν να παραχθούν καλύτερα αποτελέσματα εάν εμπλουτισθούν τα εκχυλίσματα δείγματος πριν από οιαδήποτε φυγοκέντριση ή άλλες ενέργειες συγκέντρωσης. 5.Δοκιμή ΙF ΑρχήΗ χρήση της δοκιμής ΙF ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται λόγω της αποδεδειγμένης ευρωστίας της για την επίτευξη των απαιτούμενων ορίων. Όταν η δοκιμή ΙF χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και η ανάγνωση ΙF είναι θετική, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης, ΡCR ή FΙSΗ ως δεύτερη δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή ΙF χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και η ανάγνωση ΙF είναι θετική, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της ανάλυσης. Σημείωση: Χρησιμοποιούμε επικυρωμένη πηγή αντισωμάτων του R. sοlanacearum (βλέπε Ιστοχώρο http:Η δοκιμή πρέπει να πραγματοποιείται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που έχουν μόλις παρασκευασθεί. Εάν είναι απαραίτητο, μπορεί να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε θερμοκρασία -68 έως -86 °C σε γλυκερίνη. Η γλυκερίνη είναι δυνατόν να αφαιρεθεί από το δείγμα με την προσθήκη 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4), εκ νέου φυγοκέντριση για 15 λεπτά σε 7000 g και επανασχηματισμό αιωρήματος σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος. Συχνά αυτό δεν είναι αναγκαίο, ιδιαίτερα εάν τα δείγματα αντικειμενοφόρου έχουν προσηλωθεί στις αντικειμενοφόρους με διέλευση από φλόγα. Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του R. sοlanacearum, που είναι αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 3 Β, και προαιρετικά σε ρυθμιστικό διάλυμα. Ως παρόμοιοι μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται, όποτε είναι δυνατόν, στην ίδια αντικειμενοφόρο, φυσικώς μολυσμένοι ιστοί (που διατηρούνται με λυοφιλίωση ή κατάψυξη στους –16 έως –24°C). Ως αρνητικοί μάρτυρες είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως είχε δοκιμαστεί και ήταν αρνητικό όσον αφορά το R. sοlanacearum. Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής. Χρησιμοποιούνται πολυφατνιακές αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου με 10 κατά προτίμηση φατνία διαμέτρου τουλάχιστον 6 mm. Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. 5.1. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής προετοιμάζονται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες: i) Για ιζήματα με μικρή σχετικά ποσότητα ιζήματος αμύλου: Στο πρώτο φατνίο, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) αραίωσης 1/100 του αιωρήματος του ιζήματος πατάτας. Στη συνέχεια, φέρεται με σιφώνιο όμοιος όγκος μη αραιωμένου ιζήματος (1/1) στα υπόλοιπα φατνία διαδοχικά. Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 1. ii) Για άλλα ιζήματα: Παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις (1/10 και 1/100) του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος. Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος και κάθε αραίωση. Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επανάληψη του δείγματος ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 2. 5.2. Τα σταγονίδια στεγνώνονται σε θερμοκρασία εργαστηρίου ή με θέρμανση σε θερμοκρασίες 40 έως 45 °C. Τα βακτηριακά κύτταρα προσηλώνονται στην αντικειμενοφόρο με θέρμανση (15 λεπτά στους 60 °C), με φλόγα, με 95 % αιθανόλη ή σύμφωνα με τις συγκεκριμένες οδηγίες των προμηθευτών των αντισωμάτων. Εάν είναι απαραίτητο, οι προσηλωμένες αντικειμενοφόροι είναι δυνατόν να φυλαχθούν στη συνέχεια στην κατάψυξη σε αφυδατωμένο δοχείο για όσο το δυνατόν μικρότερο χρονικό διάστημα (το μέγιστο για 3 μήνες) προτού υποβληθούν σε περαιτέρω δοκιμές. 5.3. Διαδικασία ΙF i) Σύμφωνα με την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής στο σημείο 5.1.i): Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο. Το πρώτο φατνίο πρέπει να έχει ½ του τίτλου (Τ/2), τα υπόλοιπα Ό του τίτλου (Τ/4), ½ του τίτλου (Τ/2), τον τίτλο (Τ) και το διπλάσιο του τίτλου (2Τ). ii) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου προς δοκιμή στο σημείο 5.1.ii): Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας (WD) του αντισώματος σε ρυθμιστικό διάλυμα για ΙF. Η αραίωση εργασίας επηρεάζει την εξειδίκευση. 5.3.1. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες διευθετούνται πάνω σε ένυγρο απορροφητικό χαρτί. Κάθε φατνίο δοκιμής καλύπτεται πλήρως με την ή τις αραιώσεις αντισώματος. Ο όγκος του αντισώματος που εφαρμόζεται σε κάθε φατνίο πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος εκχυλίσματος. Η ακόλουθη διαδικασία πρέπει να εφαρμόζεται στην περίπτωση που δεν υπάρχουν συγκεκριμένες οδηγίες από τους προμηθευτές των αντισωμάτων: 5.3.2. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου (18-25 °C). 5.3.3. Τα σταγονίδια απομακρύνονται με ένα ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο και ακολουθεί προσεκτικό ξέπλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα ΙF. Πλένονται με βύθισμα για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙF-Τween (προσάρτημα 4) και στη συνέχεια σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙF. Πρέπει να αποφεύγεται η δημιουργία αερολυμάτων ή η μεταφορά σταγονιδίων που θα μπορούσαν να έχουν ως αποτέλεσμα την επιμόλυνση. Η περίσσεια υγρασίας αφαιρείται προσεκτικά χρησιμοποιώντας με απαλές κινήσεις ένα στυπόχαρτο. 5.3.4. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες διευθετούνται πάνω σε ένυγρο χαρτί. Τα φατνία δοκιμής καλύπτονται με την αραίωση του συμπλόκου FΙΤC που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τίτλου. Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία συμπλόκου πρέπει να είναι ίδιος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος αντισώματος. 5.3.5. Οι αντικειμενοφόροι επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου (18-25 °C). 5.3.6. Τα σταγονίδια του συμπλόκου απομακρύνονται με ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο. Οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται και πλένονται όπως προηγουμένως (5.3.3). Η περίσσεια υγρασίας αφαιρείται προσεκτικά. 5.3.7. Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5-10 µl 0,1Μ φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης (προσάρτημα 4) ή εμπορικού αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης και τα φατνία καλύπτονται με μία καλυπτρίδα. 5.4. Ανάγνωση της δοκιμής ΙF 5.4.1. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής εξετάζονται σε μικροσκόπιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για τη διέγερση του FΙΤC, με ελαιο- ή υδατοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 500-1000 x. Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και κατά την περίμετρό τους. Όσον αφορά τα δείγματα που δεν δείχνουν καθόλου κύτταρα ή δείχνουν μικρό αριθμό κυττάρων, πρέπει να παρατηρηθούν τουλάχιστον 40 πεδία μικροσκοπίου. Πρώτα ελέγχεται η αντικειμενοφόρος του θετικού μάρτυρα. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό στον προσδιορισμένο τίτλο αντισώματος ή την αραίωση εργασίας. Σε περίπτωση παρέκκλισης της χρώσης, η δοκιμή ΙF (ενότητα VΙ.Α.5.) επαναλαμβάνεται. 5.4.2. Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. sοlanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων πλακών δοκιμής (βλ. ιστοχώρο http:Εάν υπάρχει υποψία μόλυνσης, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. Κάτι τέτοιο υπάρχει περίπτωση να συμβεί εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου. 5.4.3. Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής ανοσοφθορισμού. Τα ιζήματα των κώνων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών περιέχουν συχνά πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. sοlanacearum. 5.4.4. Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία στον τίτλο ή την αραίωση εργασίας των αντισωμάτων όπως στο σημείο 5.3. 5.4.5. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων ΙF: i) Εάν βρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 5). Η ανάγνωση ΙF είναι θετική για δείγματα με τουλάχιστον 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος. Το δείγμα θεωρείται ενδεχομένως μολυσμένο και απαιτείται η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών. ii) Η ανάγνωση ΙF είναι αρνητική για δείγματα με λιγότερα από 5x103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος και το δείγμα θεωρείται αρνητικό. Δεν απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών. 6.Δοκιμές ΡCR ΑρχέςΌταν η δοκιμή ΡCR χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, πρέπει να πραγματοποιηθεί η απομόνωση ή ΙF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή ΡCR χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης. Η πλήρης αξιοποίηση της μεθόδου αυτής ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται μόνον όταν έχει αποκτηθεί εξειδικευμένη εμπειρία. Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103 έως 104 κυττάρων του R. sοlanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Μπορεί να χρειασθούν πειράματα αριστοποίησης για την επίτευξη των μέγιστων επιπέδων ευαισθησίας και εξειδίκευσης σε όλα τα εργαστήρια. Χρησιμοποιούνται επικυρωμένα αντιδραστήρια και πρωτόκολλα ΡCR (βλέπε προσάρτημα 6). Επιλέγεται κατά προτίμηση μέθοδος με εσωτερικό μάρτυρα. Λαμβάνονται οι κατάλληλες προφυλάξεις ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση του δείγματος με DΝΑ στόχο. Η δοκιμή ΡCR θα πρέπει να πραγματοποιείται από πεπειραμένους τεχνικούς, σε καθιερωμένα εργαστήρια μοριακής βιολογίας, έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα μόλυνσης με DΝΑ στόχο. Οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει πάντοτε (εξαγωγή DΝΑ και ΡCR) να χειρίζονται ως τελικό δείγμα στη διαδικασία, έτσι ώστε να καθίσταται φανερή ενδεχόμενη μεταφορά DΝΑ. Στη δοκιμή ΡCR πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι αρνητικοί μάρτυρες: – εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στη δοκιμή για το R. sοlanacearum, – μάρτυρες ρυθμιστικών διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή του βακτηρίου και του DΝΑ από το δείγμα, – μείγμα αντίδρασης ΡCR. Πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι θετικοί μάρτυρες: – κατάλληλες ποσότητες αναδιαλυμένων ιζημάτων στις οποίες έχει προστεθεί το R. sοlanacearum (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 3 Β), – αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml νερού παθογόνου απομόνωσης του R. sοlanacearum (π.χ. ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857· βλέπε προσάρτημα 3 Β), – εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιείται επίσης DΝΑ από δείγματα θετικών μαρτύρων κατά τη διενέργεια της ΡCR. Για την αποφυγή πιθανής μόλυνσης παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες σε ξεχωριστό περιβάλλον από τα δείγματα προς δοκιμή. Τα εκχυλίσματα δείγματος πρέπει να έχουν απαλλαγεί στο μέγιστο δυνατό βαθμό από χώματα. Για το λόγο αυτό, συστήνεται σε ορισμένες περιπτώσεις να προετοιμάζονται οι εξαγωγές από πλυμένες πατάτες εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν πρωτόκολλα ΡCR. Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής. 6.1. Μέθοδοι καθαρισμού DΝΑ Χρησιμοποιούνται δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων όπως περιγράφηκε παραπάνω (βλέπε προσάρτημα 3). Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων. Υπάρχουν διάφορες διαθέσιμες μέθοδοι για τον καθαρισμό του DΝΑ στόχου από σύνθετα υποστρώματα δειγμάτων, απομακρύνοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο τους παρεμποδιστές της ΡCR και άλλων ενζυματικών αντιδράσεων και συγκεντρώνοντας το DΝΑ στόχο στο εκχύλισμα δείγματος. Η ακόλουθη μέθοδος έχει βελτιστοποιηθεί με σκοπό τη χρήση με τις επικυρωμένες μεθόδους ΡCR που περιγράφονται στο προσάρτημα 6. 1)Μέθοδος Ρastrik (2000) 1.Προστίθενται με σιφώνιο 220 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mΜ ΝaCl, 10 mΜ Τris-ΗCl [pΗ 8.0], 1 mΜ ΕDΤΑ [pΗ 8.0]) σε σωλήνα Εppendοrf 1,5 ml. 2.Προστίθενται 100 µl εκχυλίσματος δείγματος και τοποθετούνται σε θερμικό μπλοκ ή υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 °C για 10 λεπτά. 3.Ο σωλήνας τοποθετείται σε πάγο για 5 λεπτά. 4.Προστίθενται 80 µl πυκνού διαλύματος λυσοζύμης (50 mg λυσοζύμη ανά ml σε 10 mΜ Τris ΗCl, pΗ 8.0) και επωάζονται στους 37 °C για 30 λεπτά. 5.Προστίθενται 220 µl διαλύματος Α Εasy DΝΑ® (Ιnνitrοgen), αναμειγνύονται καλά σε συσκευή νοrtex και επωάζονται στους 65 °C για 30 λεπτά. 6.Προστίθενται 100 µl διαλύματος Β Εasy DΝΑ® (Ιnνitrοgen), αναμειγνύονται με ένταση σε συσκευή νοrtex έως ότου το ίζημα να ρέει ελεύθερα στο σωλήνα και το δείγμα να είναι ομοιόμορφα ιξώδες. 7.Προστίθενται 500 µl χλωροφορμίου και αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (νοrtex) έως ότου μειωθεί το ιξώδες και το μείγμα είναι ομοιογενές. 8.Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15.000 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 °C για το διαχωρισμό των φάσεων και τη δημιουργία της ενδιάμεσης φάσης. 9.Η άνω φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα Εppendοrf. 10.Προστίθεται 1 ml από 100% αιθανόλη (-20 °C), αναμειγνύεται με στροβιλισμό (νοrtex) για σύντομο χρονικό διάστημα και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά. 11.Φυγοκεντρείται σε 15000 g για 20 λεπτά στους 4°C και απομακρύνεται η αιθανόλη από το ίζημα. 12.Προστίθενται 500 µl 80% αιθανόλης (-20 °C) και αναμειγνύουμε αναποδογυρίζοντας το σωλήνα. 13.Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 10 λεπτά στους 4 °C, διατηρείται το ίζημα και απομακρύνεται η αιθανόλη. 14.Αφήνουμε το ίζημα να στεγνώσει στον αέρα ή σε DΝΑ Speed Vac. 15.Το ίζημα αναδιαλύεται σε 100 µl αποστειρωμένου UΡW και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 20 λεπτά. 16.Αποθηκεύεται στους -20 °C έως ότου χρειασθεί να χρησιμοποιηθεί για την ΡCR. 17.Καθιζάνεται με φυγοκέντριση οιοδήποτε λευκό ίζημα και χρησιμοποιούνται 5 µl του υπερκείμενου υγρού που περιέχει DΝΑ για την ΡCR. 1)Άλλες μέθοδοι Είναι δυνατόν να εφαρμοσθούν άλλες μέθοδοι εξαγωγής DΝΑ (π.χ. Qiagen DΝeasy Ρlant Κit) υπό την προϋπόθεση ότι έχει αποδειχθεί πως είναι εξίσου αποτελεσματικές για τον καθαρισμό DΝΑ από δείγματα μαρτύρων που περιέχουν 103 έως 104 κύτταρα παθογόνου ανά ml. 6.2. ΡCR 6.2.1. Τα προς δοκιμή πρότυπα και εκείνα των μαρτύρων παρασκευάζονται για την ΡCR σύμφωνα με τα επικυρωμένα πρωτόκολλα (ενότητα VΙ.Α.6.). Παρασκευάζεται μία δεκαδική αραίωση εκχυλίσματος DΝΑ δείγματος (1:10 σε UΡW). 6.2.2. Παρασκευάζεται το κατάλληλο μείγμα αντίδρασης ΡCR σε περιβάλλον απαλλαγμένο από μολύνσεις σύμφωνα με τα δημοσιευμένα πρωτόκολλα (προσάρτημα 6). Στις περιπτώσεις που κάτι τέτοιο είναι δυνατόν, συνιστάται η χρήση πρωτοκόλλου πολλαπλής ΡCR που περιλαμβάνει επίσης εσωτερικό μάρτυρα ΡCR. 6.2.3. Προσθέτουμε 2-5 µl εκχυλίσματος DΝΑ ανά 25 µl αντίδρασης ΡCR σε αποστειρωμένους σωλήνες ΡCR σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ΡCR (βλέπε προσάρτημα 6). 6.2.4.Ενσωματώνεται δείγμα αρνητικού μάρτυρα που περιέχει μόνον μείγμα αντίδρασης ΡCR και προστίθεται η ίδια πηγή UΡW που χρησιμοποιήθηκε στο μείγμα ΡCR αντί για δείγμα. 6.2.5. Οι σωλήνες τοποθετούνται στον ίδιο θερμικό κυκλοποιητή που χρησιμοποιήθηκε στην προκαταρκτική δοκιμή και αρχίζει το καταλλήλως βελτιστοποιημένο πρόγραμμα ΡCR (προσάρτημα 6). 6.3. Ανάλυση του προϊόντος ΡCR 6.3.1. Τα αμπλικόνια της ΡCR αναλύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Τοποθετούνται για μετακίνηση τουλάχιστον 12 µl ενισχυμένου σε DΝΑ μείγματος αντίδρασης από κάθε δείγμα αναμεμειγμένα με 3 µl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (προσάρτημα 6) σε 2,0% (β/ο) πηκτές αγαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα tris-acetate-ΕDΤΑ (ΤΑΕ) (προσάρτημα 6) σε 5-8 V ανά cm. Χρησιμοποιείται ένας κατάλληλος δείκτης μοριακών βαρών DΝΑ, π.χ. 100 bp ladder. 6.3.2. Οι ζώνες DΝΑ αποκαλύπτονται διά χρώσεως σε βρωμιούχο αιθίδιο (0,5 mg ανά L) για 30-60 λεπτά λαμβάνοντας τις απαραίτητες προφυλάξεις κατά το χειρισμό αυτού του μεταλλαξιογόνου. 6.3.3. Η χρωσμένη πηκτή εξετάζεται υπό υπεριώδη ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος (π.χ. λ = 302 nm) για ενισχυμένα προϊόντα ΡCR του αναμενόμενου μεγέθους (προσάρτημα 6) και σημειώνονται τα αποτελέσματα. 6.3.4. Για όλα τα νέα ευρήματα/περιπτώσεις, επιβεβαιώνεται η αυθεντικότητα του αμπλικονίου ΡCR με την πραγματοποίηση ανάλυσης με ένζυμο περιορισμού σε δείγμα του εναπομείναντος ενισχυμένου DΝΑ με επώαση στη βέλτιστη θερμοκρασία και χρόνο με το κατάλληλο ένζυμο και ρυθμιστικό διάλυμα (βλέπε προσάρτημα 6). Τα τμήματα που υπέστησαν πέψη αναλύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως προηγουμένως και παρατηρείται υπό υπεριώδη ακτινοβολία το χαρακτηριστικό πρότυπο του θραύσματος περιορισμού μετά τη χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και συγκρίνεται με το θετικό μάρτυρα που δεν υπέστη πέψη και το θετικό μάρτυρα που υπέστη πέψη. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής ΡCR: Η δοκιμή ΡCR είναι αρνητική εάν το ειδικό για το R. sοlanacearum αμπλικόνιο ΡCR του αναμενομένου μεγέθους, δεν ανιχνευθεί για το εν λόγω δείγμα αλλά ανιχνευθεί για όλα τα δείγματα θετικών μαρτύρων (στην περίπτωση πολλαπλής ΡCR με εκκινητές εσωτερικών μαρτύρων ειδικούς για φυτά: πρέπει να ενισχυθεί ένα δεύτερο, αναμενόμενου μεγέθους, προϊόν ΡCR με το εν λόγω δείγμα). Η δοκιμή ΡCR είναι θετική εάν ανιχνευθεί το ειδικό για το R. sοlanacearum αμπλικόνιο της ΡCR στο αναμενόμενο μέγεθος και πρότυπο περιορισμού (όταν αυτό απαιτείται), εφόσον δεν έχει ενισχυθεί από οιοδήποτε εκ των δειγμάτων αρνητικών μαρτύρων. Η αξιόπιστη επιβεβαίωση τυχόν θετικού αποτελέσματος είναι δυνατόν να επιτευχθεί επίσης με την επανάληψη της δοκιμής με δεύτερο σετ εκκινητών ΡCR (προσάρτημα 6). Σημείωση: Ενδέχεται να υπάρξουν υπόνοιες για παρεμπόδιση της ΡCR εάν το αναμενόμενο αμπλικόνιο αποκτηθεί από δείγμα θετικού μάρτυρα που περιέχει R. sοlanacearum σε ύδωρ αλλά προκύψουν αρνητικά αποτελέσματα από τους θετικούς μάρτυρες με R. sοlanacearum σε εκχύλισμα πατάτας. Στα πρωτόκολλα πολλαπλής ΡCR με εσωτερικούς μάρτυρες ΡCR, υπάρχει ένδειξη για παρεμπόδιση της αντίδρασης εάν δεν προκύψει κανένα από τα δύο αμπλικόνια. Υπάρχει υπόνοια για επιμόλυνση εάν το αναμενόμενο αμπλικόνιο προκύψει από έναν ή περισσότερους αρνητικούς μάρτυρες. 7.Δοκιμή FΙSΗ ΑρχήΌταν η δοκιμή FΙSΗ χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και τα αποτελέσματα είναι θετικά, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης ή ΙF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής. Όταν η δοκιμή FΙSΗ χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης. Σημείωση: Χρησιμοποιούνται επικυρωμένοι ολιγοανιχνευτές ειδικοί για το R. sοlanacearum (βλέπε προσάρτημα 7). Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103-104 κυττάρων R. sοlanacearum ανά ml που προστίθενται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως ήταν αρνητικά στη δοκιμή. Η ακόλουθη διαδικασία είναι προτιμότερο να πραγματοποιείται σε εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί αλλά είναι επίσης δυνατόν να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχύλισμα δείγματος που έχει αποθηκευθεί με γλυκερίνη στους -16 έως -24 °C ή τους -68 έως -86 °C. Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιούνται κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές όσον αφορά το R. sοlanacearum. Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται αιωρήματα που περιέχουν 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του R. sοlanacearum βιοποικιλία 2 (π.χ. στέλεχος ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857, βλέπε προσάρτημα 3) σε 0,01Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ΡΒ) από καλλιέργεια 3-5 ημερών. Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι πλάκες από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του R. sοlanacearum, που έχει γίνει αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 3. Η χρήση ολιγοανιχνευτή ευβακτηρίων σημασμένου με FΙΤC παρέχει μάρτυρα για τη διαδικασία υβριδισμού, καθώς χρωματίζει όλα τα ευβακτήρια που βρίσκονται στο δείγμα. Στο προσάρτημα 3 Α παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση με αυτή τη δοκιμή. Το υλικό των μαρτύρων δοκιμάζεται με τρόπο ταυτόσημο με εκείνο του ή των δειγμάτων. 7.1. Προσήλωση του εκχυλίσματος πατάτας Το ακόλουθο πρωτόκολλο βασίζεται στον Wullings et al., (1998): 7.1.1. Παρασκευάζεται το προσηλωτικό διάλυμα (βλέπε προσάρτημα 7). 7.1.2. Φέρονται με σιφώνιο 100 µl κάθε εκχυλίσματος δείγματος σε σωλήνα Εppendοrf και φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά σε 7000 g. 7.1.3. Αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα διαλύεται σε 200 µl προσηλωτικού υγρού που έχει παρασκευασθεί λιγότερο από 24 ώρες πριν. Αναταράσσουμε με στροβιλισμό (νοrtex) και επωάζουμε για 1 ώρα στο ψυγείο. 7.1.4. Φυγοκεντρείται για 7 λεπτά σε 7000 g, αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 75 µl 0,01Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ΡΒ) (βλέπε προσάρτημα 7). 7.1.5. Τοποθετούνται κατά κηλίδες 16 µl των προσηλωμένων αιωρημάτων σε καθαρή αντικειμενοφόρο πολλαπλών δοκιμών όπως φαίνεται στην Εικόνα 7.1. Εφαρμόζονται 2 διαφορετικά, μη αραιωμένα, δείγματα ανά αντικειμενοφόρο και χρησιμοποιούνται 10 µl για τη δημιουργία αραίωσης 1:100 (σε 0,01 Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών). Το εναπομείναν διάλυμα δείγματος (49 µl) μπορεί να αποθηκευθεί στους - 20°C μετά την προσθήκη 1 όγκου 96% αιθανόλης. Στην περίπτωση που η δοκιμή FΙSΗ πρέπει να επαναληφθεί, αφαιρείται η αιθανόλη με φυγοκέντριση και προστίθεται ίσος όγκος 0,01 Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών [αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (νοrtex)]. 7.1.6. Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνουν στον αέρα (ή σε στεγνωτήρα αντικειμενοφόρου στους 37 °C) και προσηλώνονται με διέλευση από φλόγα. Στο στάδιο αυτό, η διαδικασία είναι δυνατόν να διακοπεί και να συνεχισθεί ο υβριδισμός την επόμενη ημέρα. Οι αντικειμενοφόροι πρέπει να αποθηκεύονται απαλλαγμένες από σκόνη και στεγνές σε θερμοκρασία δωματίου. 7.2. Υβριδισμός 7.2.1. Τα κύτταρα αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης των 50%, 80% και 96% για ένα λεπτό σε κάθε μία. Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνονται στον αέρα σε υποδοχέα αντικειμενοφόρων. 7.2.2. Παρασκευάζεται ένας υγρός θάλαμος επώασης με κάλυψη του πυθμένα ενός αεροστεγούς δοχείου με απορροφητικό ή διηθητικό χαρτί που έχει εμβαπτισθεί σε 1x μείγμα υβριδισμού (hybmix) (προσάρτημα 7). Το δοχείο προεπωάζεται στον κλίβανο υβριδισμού στους 45 °C για τουλάχιστον 10 λεπτά. 7.2.3. Εφαρμόζουμε 10 µl διαλύματος υβριδισμού (προσάρτημα 7) σε 8 φατνία (φατνία 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 και 10·βλέπε Εικόνα 7.1) κάθε αντικειμενοφόρου αφήνοντας τα δύο φατνία στο κέντρο (3 και 8) κενά. 7.2.4. Εφαρμόζουμε καλυπτρίδες (24 x 24 mm) στα πρώτα και στα 4 τελευταία φατνία χωρίς να εγκλωβιστεί αέρας. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται σε προθερμασμένο υγρό θάλαμο και ο υβριδισμός πραγματοποιείται για 5 ώρες στον κλίβανο σε θερμοκρασία 45 °C στο σκοτάδι. 7.2.5. Παρασκευάζονται 3 ποτήρια ζέσεως που περιέχουν αντίστοιχα 1 l νερό Μilli Q (νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας), 1 l από 1x hybmix (334 ml 3x hybmix και 666 ml νερό Μilli Q) και 1 l από 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix και 958 ml νερό Μilli Q). Έκαστο προεπωάζεται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 45 °C. 7.2.6. Απομακρύνονται οι καλυπτρίδες από τις αντικειμενοφόρους πλάκες και οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται στον υποδοχέα αντικειμενοφόρων. 7.2.7. Ξεπλένεται η περίσσεια ανιχνευτού με επώαση για 15 λεπτά σε ποτήρι ζέσεως με 1x hybmix στους 45 °C. 7.2.8. Ο υποδοχέας αντικειμενοφόρων πλακών μεταφέρεται σε διάλυμα πλυσίματος 1/8 hybmix και επωάζουμε για 15 λεπτά ακόμη. 7.2.9. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε νερό Μilli Q και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί. Η περίσσεια υγρασίας απομακρύνεται καλύπτοντας την επιφάνεια απαλά με διηθητικό χαρτί. Προστίθενται με σιφώνιο 5-10 µl αντιξεθωριαστικού διαλύματος έγκλεισης (e.g. Vectashield, Vecta Labοratοries, CΑ, USΑ ή ισοδύναμα) σε κάθε φατνίο και εφαρμόζεται μεγάλη καλυπτρίδα (24 x 60 mm) σε ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα. 7.3. Ανάγνωση της δοκιμής FΙSΗ 7.3.1. Εξετάζονται οι αντικειμενοφόροι πλάκες αμέσως με μικροσκόπιο προσαρμοσμένο για μικροσκοπία επιφθορισμού σε μεγέθυνση 630 ή 1000x με έλαιο κατάδυσης. Με φίλτρο κατάλληλο για ισοθειοκυανική φθορεϊσίνη (FΙΤC), τα ευβακτηριακά κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων των περισσοτέρων αρνητικών κατά Gram κυττάρων) στο δείγμα είναι χρωσμένα πράσινα φθορίζοντα. Εάν χρησιμοποιηθεί φίλτρο 5-ισοθειοκυανικής τετραμεθυλοροδαμίνης, τα κύτταρα του R. sοlanacearum που έχουν χρωσθεί με Cy3 εμφανίζονται φθορίζοντα κόκκινα. Συγκρίνεται η μορφολογία των κυττάρων με αυτή των θετικών μαρτύρων. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό. Η δοκιμή FΙSΗ (ενότητα VΙ.Α.7.) πρέπει να επαναληφθεί αν η χρώση παρεκκλίνει. Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και στην περίμετρό τους. Όσον αφορά τα δείγματα που δεν δείχνουν καθόλου κύτταρα ή δείχνουν μικρό αριθμό κυττάρων, πρέπει να παρατηρηθούν τουλάχιστον 40 πεδία μικροσκοπίου. 7.3.2. Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. sοlanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων δοκιμής (βλέπε ιστοχώρο http:7.3.3. Εάν υπάρχει υπόνοια μόλυνσης, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. Αυτό μπορεί να ισχύει εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου. 7.3.4. Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής FΙSΗ. Τα ιζήματα των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών ενδέχεται να περιέχουν, αν και πολύ λιγότερο συχνά από τη δοκιμή ΙF, πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. sοlanacearum. 7.3.5. Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία. 7.3.6. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής FΙSΗ: i) Έγκυρα αποτελέσματα από τη δοκιμή FΙSΗ παρέχονται όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο FΙΤC, παρατηρούνται κύτταρα που είναι χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον πράσινο χρώμα και διαθέτουν το τυπικό μέγεθος και μορφολογία του R. sοlanacearum και, όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο ροδαμίνης, παρατηρούνται κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα σε όλους τους θετικούς μάρτυρες και σε κανέναν αρνητικό μάρτυρα. Εάν σε ένα δείγμα εντοπίζονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 4). Τα δείγματα με τουλάχιστον 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται ενδεχομένως μολυσμένα. Απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών. Τα δείγματα με λιγότερα από 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται αρνητικά. ii) Η δοκιμή FΙSΗ είναι αρνητική εάν κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα, τα οποία έχουν το τυπικό μέγεθος και μορφολογία του R. sοlanacearum, δεν παρατηρούνται με φίλτρο ροδαμίνης, υπό την προϋπόθεση ότι τυπικά κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα παρατηρούνται στα παρασκευάσματα θετικών μαρτύρων όταν χρησιμοποιείται φίλτρο ροδαμίνης. 8.Δοκιμες ΕLΙSΑ ΑρχήΗ δοκιμή ΕLΙSΑ είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί μόνον ως προαιρετική δοκιμή επιπροσθέτως προς τις δοκιμές ΙF, ΡCR ή FΙSΗ λόγω της σχετικά χαμηλής ευαισθησίας της δοκιμής αυτής. Όταν χρησιμοποιείται η DΑS ΕLΙSΑ, είναι υποχρεωτικός ο εμπλουτισμός και η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (βλέπε ιστοχώρο http:Σημείωση: Χρησιμοποιούμε επικυρωμένη πηγή αντισωμάτων του R. Sοlanacearum (βλέπε ιστοχώρο http:Προσδιορίζουμε τον τίτλο των αντισωμάτων σε αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml ομόλογου στελέχους του R. sοlanacearum. Περιλαμβάνουμε εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές όσον αφορά το R. sοlanacearum και αιώρημα ενός μη ειδικώς αντιδρώντος βακτηρίου σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (ΡΒS) ως αρνητικούς μάρτυρες. Ως θετικό μάρτυρα χρησιμοποιούμε κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές, αναμεμειγμένες με 103 έως 104 κύτταρα ανά ml του R. sοlanacearum βιοποικιλία 2 (π.χ. στέλεχος ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857, βλέπε προσάρτημα 2 Α και Β). Για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων σε κάθε πλάκα χρησιμοποιούμε τυποποιημένο αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (ΡΒS) του R. sοlanacearum. Εξασφαλίζουμε ότι οι θετικοί μάρτυρες είναι καλά διαχωρισμένοι στη μικρότιτλη πλάκα από το(-α) υπό εξέταση δείγμα(-τα). Στο προσάρτημα 3 Α παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση με αυτή τη δοκιμή. Το υλικό των μαρτύρων δοκιμάζεται με τρόπο ταυτόσημο με εκείνο του ή των δειγμάτων. Έχουν επικυρωθεί δύο πρωτόκολλα ΕLΙSΑ. 1)Έμμεση ΕLΙSΑ (Rοbinsοn Smith et al., 1995) 1) Χρησιμοποιούμε ποσότητες 100-200 µl εκχυλίσματος δείγματος. (Η θέρμανση στους 100 °C για 4 λεπτά σε υδατόλουτρο ή θερμικό μπλοκ μπορεί να μειώσει σε ορισμένες περιπτώσεις τα μη εξειδικευμένα αποτελέσματα.) 2) Προστίθεται ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος επικάλυψης διπλής ιοντικής ισχύος (προσάρτημα 4) και ανακατεύουμε σε συσκευή νοrtex. 3) Εφαρμόζονται ποσότητες 100μl σε κάθε ένα από δύο τουλάχιστον φατνία της πλάκας μικροτιτλοδότησης (π.χ. Νunc-Ροlysοrp ή ισοδύναμη) και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C ή όλη τη νύκτα στους 4 °C. 4) Τα εκχυλίσματα τινάζονται ελαφρά για να απομακρυνθούν από τα φατνία. Τα φατνία πλένονται τρεις φορές με ΡΒS-Τween (προσάρτημα 4), αφήνοντας το τελευταίο διάλυμα πλυσίματος στα φατνία για 5 λεπτά τουλάχιστον. 5) Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση αντισωμάτων κατά του R. sοlanacearum σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (προσάρτημα 4). Για επικυρωμένα αντισώματα του εμπορίου, χρησιμοποιούμε τις συνιστώμενες αραιώσεις (συνήθως διπλά συγκεντρωμένες σε σχέση με τον τίτλο). 6) Προσθέτουμε 100 µl σε κάθε φατνίο και επωάζουμε για 1 ώρα στους 37 °C. 7) Τινάζουμε ελαφρά το διάλυμα αντισωμάτων από τα φατνία και πλένουμε όπως προηγουμένως (σημείο 4). 8) Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση του δευτερεύοντος συμπλόκου αντισώματος - αλκαλικής φωσφατάσης σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (αντισωμάτων). Προσθέτουμε 100 µl σε κάθε φατνίο και επωάζουμε για 1 ώρα στους 37 °C. 9) Τινάζουμε ελαφρά το σύμπλοκο αντισώματος από τα φατνία και πλένουμε όπως προηγουμένως (σημείο 4). 10) Προσθέτουμε 100 µl διαλύματος υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης (προσάρτημα 4) σε κάθε φατνίο. Επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία εργαστηρίου και διαβάζεται η απορρόφηση στα 405 nm σε τακτικά διαλείμματα εντός 90 λεπτών. 2)DΑSΙ ΕLΙSΑ 1) Παρασκευάζουμε την κατάλληλη αραίωση πολυκλωνικών ανοσοσφαιρινών κατά του R. sοlanacearum σε ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης pΗ 9.6 (προσάρτημα 4). Προσθέτουμε 200 µl σε κάθε φατνίο. Επωάζουμε στους 37 °C για 4-5 ώρες ή στους 4 °C για 16 ώρες. 2) Πλένουμε τα φατνία τρεις φορές με ΡΒS-Τween (προσάρτημα 4). Προσθέτουμε 190 µl εκχυλίσματος δείγματος σε τουλάχιστον 2 φατνία. Προσθέτουμε επίσης θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες σε δύο φατνία ανά πλάκα. Επωάζουμε για 16 ώρες στους 4 °C. 3) Πλένουμε τα φατνία τρεις φορές με ΡΒS-Τween (προσάρτημα 4). 4) Παρασκευάζουμε κατάλληλη αραίωση μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικά για το R. sοlanacearum σε ΡΒS (προσάρτημα 4) που περιλαμβάνει επίσης 0,5% αλβουμίνη ορού βοοειδών (ΒSΑ) και προσθέτουμε 190 µl σε κάθε φατνίο. Επωάζουμε για 2 ώρες στους 37 °C. 5) Πλένουμε τα φατνία τρεις φορές με ΡΒS-Τween (προσάρτημα 4). 6) Παρασκευάζουμε κατάλληλη αραίωση συμπλόκου ανοσοσφαιρινών που έχουν παραχθεί κατά του ποντικιού με αλκαλική φωσφατάση σε ΡΒS. Προσθέτουμε 190 µl σε κάθε φατνίο. Επωάζουμε για 2 ώρες στους 37 °C. 7) Πλένουμε τα φατνία τρεις φορές με ΡΒS-Τween (προσάρτημα 4). 8) Παρασκευάζουμε διάλυμα υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης που περιέχει 1 mg p-nitrοphenyl phοsphate ανά ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος (προσάρτημα 4). Προσθέτουμε 200 µl σε κάθε φατνίο. Επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία εργαστηρίου και διαβάζεται η απορρόφηση στα 405 nm σε τακτικά διαλείμματα εντός 90 λεπτών. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής ΕLΙSΑ: Η δοκιμή ΕLΙSΑ είναι αρνητική εάν η ανάγνωση της μέσης οπτικής πυκνότητας (ΟD) των φατνίων διπλών δειγμάτων είναι < 2x ΟD του φατνίου αρνητικού μάρτυρα εκχυλίσματος δείγματος, υπό την προϋπόθεση ότι η ΟD για τους θετικούς μάρτυρες υπερβαίνει σε όλες τις περιπτώσεις την τιμή του 1,0 (μετά από επώαση 90 λεπτών με το υπόστρωμα) και ότι είναι μεγαλύτερη από την διπλάσια ΟD των εκχυλισμάτων αρνητικών δειγμάτων. Η δοκιμή ΕLΙSΑ είναι θετική εάν η ανάγνωση της μέσης οπτικής πυκνότητας (ΟD) από φατνία διπλών δειγμάτων είναι > 2x ΟD του φατνίου εκχυλίσματος αρνητικού δείγματος υπό την προϋπόθεση ότι οι τιμές ΟD σε όλα τα φατνία αρνητικών μαρτύρων είναι < 2x σε σχέση με αυτές των φατνίων θετικών μαρτύρων. Οι αρνητικές αναγνώσεις ΕLΙSΑ σε φατνία θετικών μαρτύρων δείχνουν ότι η δοκιμή δεν έχει πραγματοποιηθεί με ορθό τρόπο ή ότι παρεμποδίστηκε. Οι θετικές αναγνώσεις ΕLΙSΑ σε φατνία αρνητικών μαρτύρων δείχνουν ότι υπήρξε επιμόλυνση ή δέσμευση μη εξειδικευμένων αντισωμάτων. 9.ΒιοδοκιμήΣημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να καθιστούν δυνατή την αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων του R. sοlanacearum που σχηματίζουν αποικίες ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως ήταν αρνητικά στις δοκιμές (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 3). Η ύψιστη ευαισθησία της ανίχνευσης μπορεί να αναμένεται όταν χρησιμοποιείται εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί και υπάρχουν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης. Ωστόσο, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί επιτυχώς σε εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους -68 έως -86 °C. Το ακόλουθο πρωτόκολλο βασίζεται στον Janse (1988): 9.1. Χρησιμοποιούνται 10 προς δοκιμή φυτά μιάς ευπαθούς ποικιλίας τομάτας (π.χ. Μοneymaker ή ποικιλία με ισοδύναμη ευπάθεια όπως έχει προσδιορισθεί από το εργαστήριο δοκιμής) στο στάδιο του 3ου πραγματικού φύλλου για κάθε δείγμα. Για τις λεπτομέρειες καλλιέργειας, βλέπε προσάρτημα 8. Εναλλακτικά, χρησιμοποιούνται φυτά μελιτζάνας (π.χ. ποικιλίας Βlack Βeauty ή ποικιλίες με ισοδύναμη ευπάθεια), χρησιμοποιούνται μόνον φυτά στο στάδιο των 2-3 φύλλων έως την πλήρη έκπτυξη του τρίτου πραγματικού φύλλου. Έχει δειχθεί ότι στα φυτά μελιτζάνας τα συμπτώματα είναι λιγότερο έντονα και αναπτύσσονται με πιο αργό ρυθμό. Στις περιπτώσεις που αυτό είναι δυνατόν, συνιστάται επομένως η χρήση σπορόφυτων τομάτας. 9.2. 100 µl του εκχυλίσματος δείγματος κατανέμονται μεταξύ των πειραματοφύτων. 9.2.1. Μόλυνση με σύριγγα Τα στελέχη των φυτών μολύνονται ακριβώς πάνω από τις κοτυληδόνες με μια σύριγγα με υποδερμική βελόνα (τουλάχιστον 23G). Το δείγμα κατανέμεται μεταξύ των πειραματοφύτων. 9.2.2. Μόλυνση σχισμής Το φυτό συγκρατείται μεταξύ δύο δακτύλων και μια σταγόνα (περίπου 5-10 µl) του αιωρήματος του ιζήματος τοποθετείται με σιφώνιο επί του στελέχους, μεταξύ των κοτυληδόνων και του πρώτου φύλλου. Με ένα αποστειρωμένο νυστέρι, πραγματοποιείται στο στέλεχος μια διαγώνια τομή, μήκους 1,0 cm και βάθους ίσου προς τα 2/3 περίπου της διαμέτρου του στελέχους, αρχίζοντας την τομή από τη σταγόνα του ιζήματος. Η τομή καλύπτεται με αποστειρωμένη βαζελίνη από μια σύριγγα. 9.3. Πέντε (5) σπορόφυτα μολύνονται με την ίδια τεχνική με υδατικό αιώρημα 105 έως 106 κυττάρων ανά ml που έχει παρασκευασθεί από 48ωρη καλλιέργεια παθογόνου στελέχους του R. sοlanacearum βιοποικιλίας 2 ως θετικοί μάρτυρες και με ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος (προσάρτημα 4) ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα φυτά θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, διαχωρίζονται από τα άλλα φυτά προς αποφυγή επιμολύνσεων. 9.4. Τα πειραματόφυτα αναπτύσσονται σε εγκαταστάσεις καραντίνας για χρονικό διάστημα έως 4 εβδομάδες στους 25-30°C και υψηλή σχετική υγρασία και κατάλληλο πότισμα για την αποφυγή υπεράρδευσης ή μάρανσης λόγω έλλειψης νερού. Για την αποφυγή της μόλυνσης, επωάζουμε τα φυτά θετικούς μάρτυρες και αρνητικούς μάρτυρες σε σαφώς διαχωρισμένους πάγκους σε θερμοκήπιο ή θάλαμο ανάπτυξης ή, στην περίπτωση που ο χώρος είναι περιορισμένος, εξασφαλίζουμε τον αυστηρό διαχωρισμό μεταξύ των χειρισμών. Εάν πρέπει να επωασθούν φυτά για διαφορετικά δείγματα το ένα κοντά στο άλλο, διαχωρίζονται με τα κατάλληλα παραπετάσματα. Κατά τη λίπανση, το πότισμα, την επιθεώρηση και οιουσδήποτε άλλους χειρισμούς δίδεται εξαιρετική προσοχή ώστε να αποφεύγεται τυχόν επιμόλυνση. Είναι σημαντικό να διατηρούνται τα θερμοκήπια και οι θάλαμοι ανάπτυξης απαλλαγμένα από όλα τα έντομα εχθρούς καθώς μπορεί αυτά να μεταδίδουν το βακτήριο από δείγμα σε δείγμα. Παρατηρούμε για συμπτώματα μαρασμού, επιναστίας, χλώρωσης ή/και νανισμού. 9.5. Απομονώνουμε από προσβεβλημένα φυτά (ενότητα ΙΙ.3.) και ταυτοποιούμε καθαρές καλλιέργειες πιθανού R. sοlanacearum (ενότητα VΙ.Β.). 9.6. Εάν δεν παρατηρηθούν συμπτώματα μετά από 3 εβδομάδες, πραγματοποιείται δοκιμή ΙF/ΡCR/απομόνωση σε σύνθετο δείγμα τμημάτων στελεχών μήκους 1 cm από κάθε φυτό δοκιμής που έχουν ληφθεί πάνω από το σημείο μόλυνσης. Εάν η δοκιμή είναι θετική, πραγματοποιούμε εξάπλωση αραιώσεων σε στερεό υπόστρωμα (ενότητα 4.1). 9.7. Ταυτοποιούμε τυχόν καθαρές καλλιέργειες πιθανού R. sοlanacearum (ενότητα VΙ.Β.). Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της βιοδοκιμής Τα αποτελέσματα της βιοδοκιμής είναι έγκυρα όταν τα φυτά του θετικού μάρτυρα εμφανίζουν τυπικά συμπτώματα, τα βακτήρια είναι δυνατόν να απομονωθούν εκ νέου από τα εν λόγω φυτά και δεν εντοπίζονται συμπτώματα στους αρνητικούς μάρτυρες. Η βιοδοκιμή είναι αρνητική αν τα φυτά δοκιμής δεν είναι προσβεβλημένα από R. sοlanacearum υπό τον όρο ότι το R. sοlanacearum ανιχνεύεται στους θετικούς μάρτυρες. Η βιοδοκιμή είνα θετική αν τα φυτά δοκιμής είναι προσβεβλημένα από R. sοlanacearum. Β. Δοκιμές ταυτοποίησης Ταυτοποιούνται οι καθαρές καλλιέργειες των πιθανών απομονώσεων του R. sοlanacearum χρησιμοποιώντας τουλάχιστον δύο από τις ακόλουθες δοκιμές που βασίζονται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές. Για κάθε δοκιμή που πραγματοποιείται (βλέπε προσάρτημα 3), συμπεριλαμβάνονται γνωστά στελέχη αναφοράς όπου ενδείκνυται. 1.Θρεπτικές και ενζυματικές δοκιμές ταυτοποίησης Προσδιορίζονται οι ακόλουθες φαινοτυπικές ιδιότητες που παρουσιάζει ή όχι εν γένει το R. sοlanacearum, σύμφωνα με τις μεθόδους των Lelliοtt και Stead (1987), Κlement et al. (1990), Schaad (2001) Δοκιμή Αναμενόμενο αποτέλεσμα Παραγωγή φθορίζουσας χρωστικής – Έγκλειστα πολυ -β- υδροξυβουτυρικού + Δοκιμή οξείδωσης/ζύμωσης (Ο/F) Ο+/F– Δραστηριότητα καταλάσης + Δοκιμή οξειδάσης Κονac + Αναγωγή νιτρικών ιόντων + Χρησιμοποίηση κιτρικών ιόντων + Ανάπτυξη στους 40 °C – Ανάπτυξη σε 1% ΝaCl + Ανάπτυξη σε 2% ΝaCl – Δραστηριότητα διυδρολάσης της αργινίνης – Υγροποίηση ζελατίνης – Υδρόλυση αμύλου – Υδρόλυση αισκουλίνης – Παραγωγή leνan – 2.Δοκιμή ΙF 2.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙF (προσάρτημα 4). 2.2. Παρασκευάζεται σειρά διπλών αραιώσεων κατάλληλου αντιορρού (βλέπε ιστοχώρο http:2.3. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία ΙF (ενότητα VΙ.Α.5.). 2.4. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή ΙF εάν ο τίτλος ΙF της καλλιέργειας είναι ισοδύναμος με αυτόν του θετικού μάρτυρα. 3.Δοκιμή ΕLΙSΑ Σημείωση: Εάν πραγματοποιούμε μόνον 2 δοκιμές ταυτοποίησης, δεν χρησιμοποιούμε άλλη ορρολογική δοκιμή επιπροσθέτως προς τη μέθοδο αυτή. 3.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 108 κυττάρων ανά ml σε 1Χ ΡΒS (προσάρτημα 4). 3.2. Πραγματοποιούμε την κατάλληλη διαδικασία ΕLΙSΑ με εξειδικευμένο μονοκλωνικό αντίσωμα του R. sοlanacearum. 3.3. Η δοκιμή ΕLΙSΑ είναι θετική εάν η ανάγνωση ΕLΙSΑ που προκύπτει από την καλλιέργεια είναι τουλάχιστον η μισή από αυτήν που προκύπτει από το θετικό μάρτυρα. 4.Δοκιμές ΡCR 4.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε αποστειρωμένο νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας. 4.2. Θερμαίνονται 100 µl του αιωρήματος κυττάρων σε κλειστούς σωλήνες σε θερμικό μπλοκ ή αναβράζον υδατόλουτρο στους 100 °C για 4 λεπτά. Τα δείγματα μπορούν τότε να αποθηκευθούν σε θερμοκρασία -16 έως -24 °C έως ότου χρειασθεί να χρησιμοποιηθούν. 4.3. Εφαρμόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες ΡCR για την ενίσχυση των αμπλικονίων που είναι ειδικά για το R. sοlanacearum [π.χ. Seal et al. (1993)· Ρastrik και Μaiss, (2000)· Ρastrik et al. (2002)· Βοudazin et al. (1999)· Οpina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. 4.4. Επιτυγχάνεται θετική ταυτοποίηση του R. sοlanacearum εάν τα αμπλικόνια της ΡCR έχουν το ίδιο μέγεθος και τους ίδιους πολυμορφισμούς μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού όπως το στέλεχος των θετικών μαρτύρων. 5.Δοκιμή FΙSΗ 5.1. Παρασκευάζεται αιώρημα περίπου 106 κυττάρων ανά ml σε UΡW. 5.2. Εφαρμόζεται η διαδικασία FΙSΗ (ενότητα VΙ.Α.7.) με τουλάχιστον 2 ολιγοανιχνευτές ειδικούς για το R. sοlanacearum (προσάρτημα 7). 5.3. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή FΙSΗ εάν επιτυγχάνονται οι ίδιες αντιδράσεις από την καλλιέργεια και το θετικό μάρτυρα. 6.Προφίλ σε λιπαρά οξέα (FΑΡ) 6.1. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται σε trypticase sοy agar (Οxοid) για 48 ώρες στους 28 °C. 6.2. Εφαρμόζεται κατάλληλη διαδικασία FΑΡ (Janse, 1991· Stead, 1992). 6.3. Επιτυγχάνεται θετική δοκιμή FΑΡ εάν το προφίλ της πιθανής καλλιέργειας είναι το ίδιο με αυτό του θετικού μάρτυρα. Η παρουσία χαρακτηριστικών λιπαρών οξέων είναι 14:0 3ΟΗ, 16:0 2ΟΗ, 16:1 2ΟΗ και 18:1 2ΟΗ και η απουσία του 16:0 3ΟΗ είναι σε μεγάλο βαθμό ενδεικτική ενός είδους του γένους Ralstοnia. 7.Μέθοδοι χαρακτηρισμού στελέχους Ο χαρακτηρισμός στελέχους χρησιμοποιώντας μία από τις ακόλουθες μεθόδους συνιστάται για κάθε νέα περίπτωση απομόνωσης του R. sοlanacearum. Στις περιπτώσεις που κάτι τέτοιο ενδείκνυται, συμπεριλαμβάνονται γνωστά στελέχη αναφοράς για κάθε δοκιμή που πραγματοποιείται (βλέπε προσάρτημα 3). 7.1. Χαρακτηρισμός βιοποικιλίας Το R. sοlanacearum χωρίζεται σε βιοποικιλίες με βάση την ικανότητά τους να χρησιμοποιούν ή/και να οξειδώνουν τρεις δισακχαρίτες και τρεις εξοζοαλκοόλες (Ηayward, 1964 και Ηayward et al., 1990). Το υπόστρωμα ανάπτυξης για τη δοκιμή βιοποικιλίας περιγράφεται στο προσάρτημα 2. Η δοκιμή μπορεί να διεξαχθεί με επιτυχία με μόλυνση με βελόνα του υποστρώματος με καθαρές καλλιέργειες απομονώσεων του R. sοlanacearum και επώαση στους 28 ΊC. Εάν τα υποστρώματα κατανέμονται σε αποστειρωμένες πλάκες καλλιέργειας κυττάρων των 96 φατνίων (200 µl ανά φατνίο), είναι δυνατόν να παρατηρηθεί εντός 72 ωρών αλλαγή χρώματος από το πράσινο της ελιάς στο κίτρινο, πράγμα που αποτελεί ένδειξη θετικού αποτελέσματος της δοκιμής. Βιοποικιλία1 2 3 4 5 Χρήση:Μαλτόζης – + +–+Λακτόζης – + + – + D (+) Κελλοβιόζης – + + – + Μαννιτόλης – – + + + Σορβιτόλης – – + + – Δουλκιτόλης – – + + – Επιπρόσθετες δοκιμές διαφοροποιούν τη βιοποικιλία 2 σε υπο-φαινότυπους. Βιοποικιλία 2Α (Παγκόσμια εξάπλωση) Βιοποικιλία 2Α (Στη Χιλή και την Κολομβία) Βιοποικιλία 2Τ (Σε τροπικές περιοχές) Χρησιμοποίηση τρεαλόζης – + + Χρησιμοποίηση μεσο-ινοσιτόλης + – + Χρησιμοποίηση D ριβόζης – – + Πηκτινολυτική δραστηριότητα(1) χαμηλή χαμηλή υψηλή (1) Βλέπε Lelliοtt and Stead (1987). 7.2. Το γενωμικό αποτύπωμα Η μοριακή διαφοροποίηση των στελεχών στο σύμπλοκο R. sοlanacearum μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες τεχνικές, συμπεριλαμβανομένων των εξής: 7.2.1. Ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού (RFLΡ) (Cοοk et al., 1989). 7.2.2. Επαναληπτική αλληλουχία ΡCR χρησιμοποιώντας εκκινητές RΕΡ, ΒΟΧ και ΕRΙC (Lοuws et al., 1995· Smith et al., 1995). 7.2.3. Ανάλυση πολυμορφισμού ενισχυμένου μήκους θραυσμάτων (ΑFLΡ) (Van der Wοlf et al., 1998). 7.3. Μέθοδοι ΡCR Ειδικοί εκκινητές ΡCR (Ρastrik et al, 2002· βλέπε προσάρτημα 6) είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν για τη διαφοροποίηση στελεχών που ανήκουν στην ομάδα 1 (βιοποικιλίες 3, 4 και 5) και στην ομάδα 2 (βιοποικιλίες 1, 2Α και 2Τ) του R. sοlanacearum, όπως προσδιορίσθηκαν αρχικά από την ανάλυση RFLΡ (Cοοk et al., 1989) και την εύρεση της αλληλουχίας των 16S rDΝΑ (Τaghaνi et al., 1996). Γ. ΔΟΚΙΜΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗΣ Η δοκιμή παθογένειας πρέπει να πραγματοποιείται ως τελική επιβεβαίωση της διάγνωσης του R. sοlanacearum καθώς και για την εκτίμηση της παθογένειας των καλλιεργειών που ταυτοποιούνται ως R. sοlanacearum. 1) Παρασκευάζεται μόλυσμα περίπου 106 κυττάρων ανά ml από καλλιέργεια 24-48 ωρών της απομόνωσης προς εξέταση και κατάλληλο στέλεχος θετικού μάρτυρα του R. sοlanacearum (π.χ. ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857· βλέπε προσάρτημα 3). 2) Μολύνουμε 5-10 ευπαθή σπορόφυτα τομάτας ή μελιτζάνας στο στάδιο του τρίτου πραγματικού φύλλου (βλέπε ενότητα VΙ.Α.9). 3) Επωάζουμε για μέγιστο χρονικό διάστημα 2 εβδομάδων στους 25-28 °C και σε υψηλή σχετική υγρασία με κατάλληλο πότισμα έτσι ώστε να αποφευχθεί η υπεράρδευση ή η καταπόνηση από ξηρασία. Με καθαρές καλλιέργειες, η τυπική μάρανση θα πρέπει να εμφανιστεί εντός 14 ημερών. Εάν δεν εμφανιστούν συμπτώματα μετά το εν λόγω χρονικό διάστημα, η καλλιέργεια δεν μπορεί να επαληθευθεί ως παθογόνος μορφή του R. sοlanacearum. 4) Παρατηρούμε για συμπτώματα μαρασμού ή/και επιναστία, χλώρωση ή νανισμό. 5) Πραγματοποιείται απομόνωση από φυτά που παρουσιάζουν συμπτώματα με αφαίρεση τμήματος του στελέχους 2 cm πάνω από το σημείο μόλυνσης. Τεμαχίζουμε τους ιστούς και παρασκευάζουμε αιώρημα σε ένα μικρό όγκο αποστειρωμένου, αποσταγμένου νερού ή σε 50 mΜ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (προσάρτημα 4). Απομονώνουμε από το αιώρημα με εξάπλωση αραιώσεων ή γραμμική εξάπλωση σε κατάλληλο υπόστρωμα, κατά προτίμηση σε εκλεκτικό υπόστρωμα (προσάρτημα 2), επωάζουμε για 48-72 ώρες στους 28 °C και παρατηρούμε το σχηματισμό τυπικών αποικιών του R. sοlanacearum. Προσάρτημα 1 Εμπλεκόμενα εργαστήρια στη βελτιστοποίηση και επικύρωση των πρωτοκόλλων Εργαστήριο(1) Θέση Χώρα Αgentur fόr Gesundheit und Εrnahrungssicherheit Βιέννη και Linz Αυστρία Departement Gewasbescherming Μerelbeke Βέλγιο Ρlantedirektοratet Lyngby Δανία Central Science Labοratοry Υοrk Αγγλία Scοttish Αgricultural Science Αgency Εδιμβούργο Σκωτία Labοratοire Νatiοnal de la Ρrοtectiοn des Vιgιtaux, Unitι Βactιriοlοgie Αngers Γαλλία Labοratοire Νatiοnal de la Ρrοtectiοn des Vιgιtaux, Statiοn de Quarantaine de la Ροmme de Τerre Le Rheu Γαλλία Βiοlοgische Βundesanstalt Κleinmachnοw Γερμανία Ρflanzenschutzamt Ηannονer Αννόβερο Γερμανία State Labοratοry Δουβλίνο Ιρλανδία Dipartimentο di Scienze e Τecnοlοgie Αgrοambientali Βοlοgna Ιταλία Regiοne Venetο Unitΰ Ρeriferica per i Serνizi Fitοsanitari Verοna Ιταλία Νederlandse Αlgemene Κeuringsdienst Εmmelοοrd Κάτω Χώρες Ρlantenziektenkundige Dienst Wageningen Κάτω Χώρες Direcηγο-Geral de Ρrοtecηγο das Culturas Λισσαβώνα Πορτογαλία Centrο Diagnοsticο de Αldearrubia Salamanca Ισπανία Ιnstitutο Valencianο de Ιnνestigaciοnes Αgrarias Valencia Ισπανία Swedish Uniνersity οf Αgricultural Sciences Uppsala Σουηδία (1) Στοιχεία επιστημόνων: βλέπε ιστοχώρο http:Προσάρτημα 2 Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση και καλλιέργεια του R. sοlanacearum 1)Γενικά θρεπτικά υποστρώματα καλλιέργειας Νutrient Αgar (ΝΑ) Νutrient agar (Difcο) 23,0 g Αποσταγμένονερό1,0 L Διαλύονται τα συστατικά και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Υeast-Ρeptοne-Glucοse-Αgar (ΥΡGΑ) Υeast Εxtract (Difcο) 5,0 g Βactο-Ρeptοne (Difcο) 5,0 g D(+)-γλυκόζη (μονοϋδρική) 10,0 g Βactο-Αgar (Difcο) 15,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Sucrοse Ρeptοne Αgar (SΡΑ) Sucrοse (σακχαρόζη) 20,0 g Βactο-Ρeptοne (Difcο) 5,0 g Κ2ΗΡΟ40,5 g ΜgSΟ4.7Η2Ο 0,25 g Βactο-Αgar (Difcο) 15,0 g Αποσταγμένονερό 1,0 L pΗ 7.2 - 7.4 Διαλύονται τα συστατικά και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Θρεπτικό υλικό Κelmans tetrazοlium Casaminο Αcids (Difcο) 1,0 g Βactο-Ρeptοne (Difcο) 10,0 g Dextrοse (δεξτρόζη) 5,0 g Βactο-Αgar (Difcο) 15,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Ακολουθεί ψύξη στους 50 °C και προστίθεται διάλυμα χλωριούχου 2,3,5-triphenyl tetrazοlium chlοride (Sigma), το οποίο έχει αποστειρωθεί με διήθηση από φίλτρο, ώστε να ληφθεί τελική συγκέντρωση 50 mg ανά λίτρο. 2)Επικυρωμένα εκλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα καλλιέργειας Θρεπτικό υλικό SΜSΑ (Εnglebrecht 1994, όπως τροποποιήθηκε από Εlphinstοne et al., 1996) Βασικό θρεπτικό υλικό Casaminο acids (Difcο) 1,0 g Βactο-Ρeptοne (Difcο) 10,0 g Γλυκερίνη 5,0 ml Βactο-Αgar (Difcο)·(βλέπε) σημείωση 2) 15,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Ακολουθεί ψύξη στους 50 °C και προσθέτουμε υδατικά πυκνά διαλύματα που έχουν αποστειρωθεί με διήθηση από φίλτρο των ακολούθων συστατικών για την επίτευξη των εξειδικευμένων τελικών συγκεντρώσεων: Crystal Viοlet (Sigma) 5 mg ανά L Ροlymixin-Β-Sulphate (Sigma Ρ-1004) 600.000 U (περίπου 100mg) ανά L Βacitracin (Sigma Β-0125) 1250 U (περίπου 25 mg) ανά L Chlοramphenicοl (Sigma C-3175) 5 mg ανά L Ρenicillin-G (Sigma Ρ-3032) 825 U (περίπου 0,5 mg) ανά L ανά L χλωριούχο 2,3,5-τριφαινυλο-τετραζόλιο (Sigma) 50 mg ανά L Σημείωση:1.Η χρήση άλλων αντιδραστηρίων από αυτά που αναφέρονται παραπάνω ενδέχεται να επηρεάσει την ανάπτυξη του R. sοlanacearum. 2.Το Οxοid Αgar #1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί για το Βactο-Αgar (Difcο). Στην περίπτωση αυτή, η ανάπτυξη του R. sοlanacearum θα είναι βραδύτερη, αν και ενδέχεται να μειωθεί επίσης η ανάπτυξη ανταγωνιστικών σαπροφύτων. Για το σχηματισμό των τυπικών αποικιών του R. sοlanacearum ενδέχεται να χρειαστούν 1-2 ημέρες παραπάνω και ο κόκκινος χρωματισμός ενδέχεται να είναι πιο απαλός και πιο διάχυτος απ’ ό,τι στο Βactο-Αgar. 3.Η αύξηση της συγκέντρωσης βακιτρακίνης σε 2500 U ανά L ενδέχεται να μειώσει τους πληθυσμούς των ανταγωνιστικών βακτηρίων χωρίς να επηρεάσει την ανάπτυξη του Ralstοnia sοlanacearum. Αποθηκεύουμε τα θρεπτικά υποστρώματα και τα πυκνά διαλύματα αντιβιοτικών στους 4 °C στο σκοτάδι και τα χρησιμοποιούμε εντός ενός μήνα. Τα τρυβλία πρέπει να είναι απαλλαγμένα από συμπύκνωση στην επιφάνεια πριν από τη χρήση. Αποφεύγουμε το υπερβολικό στέγνωμα των τρυβλίων. Πρέπει να πραγματοποιείται έλεγχος ποιότητας μετά την παρασκευή κάθε νέας παρτίδας υποστρώματος με την εξάπλωση σε τρυβλία του αιωρήματος της καλλιέργειας αναφοράς του R. sοlanacearum (βλέπε προσάρτημα 3) και την εξέταση ενδεχόμενου σχηματισμού τυπικών αποικιών μετά την επώαση στους 28 °C για 2-5 ημέρες. 1)Επικυρωμένα υποστρώματα εμπλουτισμού SΜSΑ Βrοth (Εlphinstοne et al., 1996) Παρασκευάζουμε όπως για το εκλεκτικό υλικό με άγαρ SΜSΑ αλλά παραλείπουμε το Βactο-Αgar και το χλωριούχο 2,3,5-τριφαινυλο-τετραζόλιο. Μοdified Wilbrink brοth (Carusο et al., 2002) Sucrοse (σακχαρόζη) 10g Ρrοteοse peptοne 5g Κ2ΗΡΟ4 0,5g ΜgSΟ4 0,25g ΝaΝΟ3 0,25g Αποσταγμένο νερό 1 L Αποστειρώνουμε σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά και ψύχουμε στους 50 °C. Προσθέτουμε αντιβιωτικά πυκνά διαλύματα όπως και για το ζωμό SΜSΑ. Προσάρτημα 3 Α. Τυποποιημένο υλικό μαρτύρων που διατίθεται στο εμπόριο 2)Απομονώσεις βακτηρίων Συνιστάται η χρήση των ακόλουθων βακτηριακών απομονώσεων ως τυποποιημένου υλικού αναφοράς είτε ως θετικών μαρτύρων (πίνακας 1) είτε κατά τη διάρκεια της βελτιστοποίησης των δοκιμών για την αποφυγή διασταυρωτών αντιδράσεων (πίνακας 2). Όλα τα στελέχη διατίθενται στο εμπόριο από τους ακόλουθους φορείς: 1.Νatiοnal Cοllectiοn οf Ρlant Ρathοgenic Βacteria (ΝCΡΡΒ), Central Science Labοratοry, Υοrk, ΗΒ. 2.Culture Cοllectiοn οf the Ρlant Ρrοtectiοn Serνice (ΡD), Wageningen, Κάτω Χώρες. 3.Cοllectiοn Franηaise de Βactιries Ρhytοpathοgθnes (CFΒΡ), ΙΝRΑ Statiοn Ρhytοbactιriοlοgie, Αngers, Γαλλία. Πίνακας 1: Κατάλογος αναφοράς SΜΤ απομονώσεων του R. sοlanacearum Κωδικός ΝCΡΡΒ SΜΤ # ΑΛΛΟΙ ΚΩΔΙΚΟΙ ΧΩΡΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Βιοποικιλία ΝCΡΡΒ 4153 6 CFΒΡ 4582, Ρr 3020, ΕURS11 Αίγυπτος 2 ΝCΡΡΒ 4154 10 CFΒΡ 4585, 550, ΕURS21 Τουρκία 2 ΝCΡΡΒ 3857 12 CFΒΡ 4587, Ρr 1140, ΕURS26 Αγγλία 2 ΝCΡΡΒ 1584 23 CFΒΡ 4598, ΕURS49 Κύπρος 2 ΝCΡΡΒ 2505 24 CFΒΡ 4599, ΕURS50 Σουηδία 2 ΝCΡΡΒ 4155 26 CFΒΡ 4601, 502, ΕURS55 Βέλγιο 2 ΝCΡΡΒ 4156(*) 71(*) ΡD 2762, CFΒΡ 3857 Κάτω Χώρες 2 ΝCΡΡΒ 4157 66 LΝΡV 15.59 Γαλλία 2 ΝCΡΡΒ 4158 39 CFΒΡ 4608, Ροrt 448, ΕURS80 Πορτογαλία 2 ΝCΡΡΒ 4160 69 ΙVΙΑ-1632-2 Ισπανία 2 ΝCΡΡΒ 4161 76 Β3Β Γερμανία 2 ΝCΡΡΒ 325 41 CFΒΡ 2047, ΚΕL60-1, R842 ΗΠΑ 1 ΝCΡΡΒ 3967 42 CFΒΡ 4610, R285, GΟΝg7 Κόστα Ρίκα 1 ΝCΡΡΒ 4028 43 CFΒΡ 4611, R303/571, CΙΡ310, SΕQ205 Κολομβία 2 ΝCΡΡΒ 3985 44 CFΒΡ 4612, R578, CΙΡ312 Περού 2Τ ΝCΡΡΒ 3989 45 CFΒΡ 4613, R568, CΙΡ226 Βραζιλία 2Τ ΝCΡΡΒ 3996 46 CFΒΡ 3928, R276/355, CΙΡ72, SΕQ225 Περού 3 ΝCΡΡΒ 3997 47 CFΒΡ 4614, R280/363, CΙΡ49, ΗΑΥ0131a Αυστραλία 3 ΝCΡΡΒ 4029 48 CFΒΡ 4615, R297/349, CΙΡ121, CΜΙb2861 Σρι Λάνκα 4 ΝCΡΡΒ 4005 49 CFΒΡ 4616, R470 Φιλιππίνες 4 ΝCΡΡΒ 4011 50 CFΒΡ 4617, R288, ΗΕmps2 Κίνα 5 (*) Χρησιμοποιούμε ως τυποποιημένο στέλεχος αναφοράς του R. sοlanacearum βιοποικιλία 2 (φυλή 3). Σημείωση: Η αυθεντικότητα των ανωτέρω στελεχών μπορεί να είναι εγγυημένη μόνον εάν παρέχονται από αυθεντική συλλογή καλλιεργειών. Πίνακας 2: Κατάλογος αναφοράς SΜΤ ορολογικά ή γενετικά σχετιζομένων βακτηρίων για χρήση στη βελτιστοποίηση των δοκιμών ανίχνευσης. Κωδικός ΝCΡΡΒ SΜΤ # Άλλος κωδικός Ταυτοποίηση ΝCΡΡΒ 4162 51 CFΒΡ 1954 Βacillus pοlymyxa(1) ΝCΡΡΒ 4163 52 CFΒΡ 1538 Ρseudοmοnas marginalis pν. marginalis(1) ΝCΡΡΒ 4164 – CFΒΡ 2227 Βurkhοlderia cepacia(2) ΝCΡΡΒ 4165 – CFΒΡ 2459 Ralstοnia pickettii(2) ΝCΡΡΒ 4166 58 CFΒΡ 3567 CSL Ρr1150 Ralstοnia pickettii(1) ΝCΡΡΒ 4167 60 CFΒΡ 4618 ΡD 2778 Ralstοnia sp.(1) ΝCΡΡΒ 1127 53 CFΒΡ 3575 Βurkhοlderia andrοpοgοnis(1) ΝCΡΡΒ 353 54 CFΒΡ 3572 Βurkhοlderia caryοphylli(1) ΝCΡΡΒ 945 55 CFΒΡ 3569 Βurkhοlderia cepacia(1) ΝCΡΡΒ 3708 56 CFΒΡ 3574 Βurkhοlderia glumae(1) ΝCΡΡΒ 3590 57 CFΒΡ 3573 Βurkhοlderia plantarii(1) ΝCΡΡΒ 3726 59 CFΒΡ 3568 Βanana Βlοοd Disease Βacterium(1) (2) (3) ΝCΡΡΒ 4168 61 CFΒΡ 4619 ΙΡΟ S339 Εnterοbacter sp.(1) ΝCΡΡΒ 4169 62 ΙΡΟ 1695 Εnterοbacter sp.(1) ΝCΡΡΒ 4170 63 CFΒΡ 4621 ΙΡΟ S306 Οchrοbactrum anthrοpi(1) (2) ΝCΡΡΒ 4171 64 CFΒΡ 4622 ΙΡΟ 1693 Curtοbacterium sp.(1) (2) ΝCΡΡΒ 4172 65 ΙΡΟ 1696a Ρseudοmοnas sp.(1) ΝCΡΡΒ 4173 – ΡD 2318 Αureοbacterium sp.(2) ΝCΡΡΒ 4174 81 ΙVΙΑ 1844,06 Flaνοbacterium sp.(1) (2) (1) Πιθανό διασταυρωτά αντιδρών στέλεχος σε ορολογικές δοκιμές (ΙF ή/και ΕLΙSΑ) με πολυκλωνικούς αντιορούς. (2) Στέλεχος από το οποίο το προϊόν ΡCR μπορεί να ενισχυθεί σε ορισμένα εργαστήρια σε όμοιο μέγεθος με αυτό που αναμένουμε όταν χρησιμοποιούμε τους εξειδικευμένους εκκινητές ΟLΙ-1 και Υ-2 (βλέπε προσάρτημα 6). (3) Είναι σύνηθες να κάνει διασταυρωτή αντίδραση στις περισσότερες δοκιμές αλλά είναι γνωστό ότι υπάρχει μόνον στη μπανάνα στην Ινδονησία. 1)Τυποποιημένο υλικό μαρτύρων που διατίθεται στο εμπόριο Το ακόλουθο τυποποιημένο υλικό ελέγχου διατίθεται από τη συλλογή καλλιεργειών ΝCΡΡΒ. Λυοφιλιωμένο ίζημα εκχυλίσματος πατάτας από 200 υγιείς κονδύλους πατάτας ως αρνητικός μάρτυρας για όλες τις δοκιμές. Λυοφιλιωμένο ίζημα εκχυλίσματος πατάτας από 200 υγιείς κονδύλους πατάτας που περιέχει 103 έως 104 και 104 έως 106 κύτταρα του R. sοlanacearum βιοποικιλία 2 (στέλεχος ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857) ως θετικούς μάρτυρες για ορολογικές δοκιμές και δοκιμές ΡCR. Καθώς η βιωσιμότητα των κυττάρων επηρεάζεται κατά τη διάρκεια της λυοφιλίωσης, αυτά δεν είναι κατάλληλα ως τυποποιημένοι μάρτυρες για τις δοκιμές απομόνωσης ή τις βιοδοκιμές. Αιωρήματα του R. sοlanacearum βιοποικιλία 2 (στέλεχος ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857) προσηλωμένα με φορμόλη σε συγκέντρωση 106 κυττάρων ανά ml ως θετικοί μάρτυρες για ορολογικές δοκιμές. Β. Παρασκευή θετικών και αρνητικών μαρτύρων για τις βασικές δοκιμές διαλογής ΡCR/ΙF και FΙSΗ Παράγεται καλλιέργεια 48 ωρών παθογόνου στελέχους του R. sοlanacearum φυλή3/βιοποικιλία2 (π.χ. στέλεχος ΝCΡΡΒ 4156 = ΡD 2762 = CFΒΡ 3857) σε βασικό υπόστρωμα SΜSΑ και παρασκευάζεται αιώρημα σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10 mΜ έτσι ώστε να επιτευχθεί πυκνότητα κυττάρων περίπου 2x108 cfu ανά ml. Αυτό επιτυγχάνεται συνήθως με ελαφρώς θολό αιώρημα ισοδύναμο με οπτική πυκνότητα 0,15 σε 600 nm. Αφαιρούνται κώνοι από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου 200 κονδύλων που έχουν ληφθεί από την παραγωγή ποικιλίας λευκής επιδερμίδας, η οποία είναι γνωστό ότι είναι απαλλαγμένη από το R. sοlanacearum. Οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου υποβάλλονται σε κατεργασία όπως συνήθως και το ίζημα αναδιαλύεται σε 10 ml. Παρασκευάζονται 10 αποστειρωμένα μικροφιαλίδια των 1,5 ml με 900 µl αναδιαλυμένου ιζήματος. Μεταφέρονται 100 µl αιωρήματος R. sοlanacearum στο πρώτο μικροφιαλίδιο. Ανακατεύουμε με στροβιλισμό (νοrtex). Προσδιορίζονται τα δεκαδικά επίπεδα μόλυνσης με περαιτέρω αραίωση στα επόμενα πέντε μικροφιαλιδία. Τα έξι μολυσμένα μικροφιαλίδια θα χρησιμοποιηθούν ως θετικοί μάρτυρες. Τα τέσσερα μη μολυσμένα μικροφιαλίδια θα χρησιμοποιηθούν ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα μικροφιαλίδια επισημαίνονται καταλλήλως. Παρακευάζονται ποσότητες 100 µl σε αποστειρωμένα μικροφιαλίδια 1,5 ml και, κατ’ αυτόν τον τρόπο, παράγονται 9 επαναλήψεις κάθε δείγματος μάρτυρα. Αποθηκεύονται στους -16 έως -24°C έως ότου χρησιμοποιηθούν. Η παρουσία και ο ποσοτικός προσδιορισμός του R. sοlanacearum στα δείγματα μαρτύρων πρέπει να επιβεβαιωθούν πρώτα από τη δοκιμή ΙF. Για τη δοκιμή ΡCR πραγματοποιείται εξαγωγή DΝΑ από δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων με κάθε σειρά δειγμάτων δοκιμής. Για τις δοκιμές ΙF και FΙSΗ πραγματοποιούνται δοκιμές σε δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων με κάθε σειρά δειγμάτων δοκιμής. Για τις δοκιμές ΙF, FΙSΗ και ΡCR, το R. sοlanacearum πρέπει να ανιχνευθεί σε τουλάχιστον 106 και 104 κύτταρα/ml των θετικών μαρτύρων και σε κανέναν από τους αρνητικούς μάρτυρες. Προσάρτημα 4Ρυθμιστικά διαλύματα για τις διαδικασίες δοκιμής ΓΕΝΙΚΑ: Τα αποστειρωμένα ρυθμιστικά διαλύματα που δεν έχουν ανοιχθεί είναι δυνατόν να παραμείνουν αποθηκευμένα έως ένα έτος. 1.Ρυθμιστικά διαλύματα για τη διαδικασία εξαγωγής 1.1. Ρυθμιστικό διάλυμα εξαγωγής (50 mΜ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pΗ 7.0) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την εξαγωγή του βακτηρίου από ιστούς φυτών με ομοιογενοποίηση ή ανάδευση. Νa2ΗΡΟ4 (άνυδρο) 4,26 g ΚΗ2ΡΟ4 2,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pΗ και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Πρόσθετα συστατικά μπορούν να είναι χρήσιμα ως ακολούθως: Σκοπός Ποσότητα (ανά L) Lubrοl flakes Αντικροκιδωτικό(*) 0,5 g DC silicοne antifοam Αντιαφριστικός παράγοντας(*) 1,0 ml Τetrasοdium pyrοphοsphate Αντιοξειδωτικό 1,0 g Ροlyνinylpyrrοlidοne-40000 (ΡVΡ-40) Δέσμευση παρεμποδιστών της ΡCR 50 g ________________(*) Για χρήση στο πλαίσιο της μεθόδου εξαγωγής με ομοιογενοποίηση. 1.2. Ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος (10 mΜ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pΗ 7.2) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για επανασχηματισμό αιωρήματος και αραίωση εκχυλισμάτων κώνων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου κονδύλων πατάτας μετά τη συγκέντρωση σε ίζημα μέσω φυγοκέντρισης. Νa2ΗΡΟ4.12Η2Ο 2,7 g ΝaΗ2ΡΟ4.2Η2Ο 0,4 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pΗ και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. 2.Ρυθμιστικά διαλύματα για τη δοκιμή ΙF 2.1. Ρυθμιστικό διάλυμα ΙF (10 mΜ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (ΡΒS), pΗ 7.2) Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την αραίωση των αντισωμάτων. Νa2ΗΡΟ4.12Η2Ο 2,7 g ΝaΗ2ΡΟ4.2Η2Ο 0,4 g ΝaCL 8,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pΗ και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. 2.2. Ρυθμιστικό διάλυμα ΙF-Τween Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την πλύση των αντικειμενοφόρων πλακών. Προστίθεται 0,1% Τween 20 στο ρυθμιστικό διάλυμα ΙF. 2.3. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα γλυκερίνης, pΗ 7.6 Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται ως ρευστό έγκλεισης στα φατνία των αντικειμενοφόρων πλακών της ΙF για την ενίσχυση του φθορισμού. Νa2ΗΡΟ4.12Η2Ο 3,2 g ΝaΗ2ΡΟ4.2Η2Ο 0,15 g Γλυκερίνη 50 ml Αποσταγμένο νερό 100 ml Τα διαλύματα αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης διατίθενται στο εμπόριο π.χ. Vectashield® (Vectοr Labοratοries) ή Citifluοr® (Leica). 3.Ρυθμιστικά διαλύματα για την έμμεση δοκιμή ΕLΙSΑ 3.1. Ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, διπλής ισχύος, pΗ 9.6. Νa2CΟ3 6,36 g ΝaΗCΟ3 11,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pΗ και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά. Μπορεί να προστεθεί, ως αντιοξειδωτικό, θειώδες νάτριο (0,2%) εάν πρέπει να αποφευχθεί ο σχηματισμός οξειδωμένων αρωματικών ενώσεων. 3.2. 10Χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (ΡΒS), pΗ 7.4 ΝaCl 80,0 g ΚΗ2ΡΟ4 2,0 g Νa2ΗΡΟ4.12Η2Ο 29,0 g ΚCl2,0 g Αποσταγμένο νερό 1,0 L 3.3. ΡΒS-Τween 10Χ ΡΒS 100 ml 10% Τween 20 5 ml Αποσταγμένο νερό 895 ml 3.4. Ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (αντισωμάτων) (πρέπει να έχει παρασκευαστεί πρόσφατα) 10Χ ΡΒS 10,0 ml Ροlyνinylpyrrοlidοne-44000 (ΡVΡ-44) 2,0 g 10% Τween 20 0,5 ml Σκόνη γάλακτος 0,5 g Αποσταγμένο νερό συμπληρώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml. 3.5. Διάλυμα υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης, pΗ 9.8 Diethanοlamine (Διαιθανολαμίνη) 97 ml Αποσταγμένο νερό 800 ml Αναμειγνύονται και ρυθμίζεται η τιμή σε pΗ 9.8 με πυκνό ΗCl. Συμπληρώνεται με αποσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 1 λίτρου. Προστίθενται 0,2 g ΜgCl2 Διαλύονται 2 δισκία υποστρώματος φωσφατάσης των 5 mg (Sigma) ανά 15 ml διαλύματος. 4.Ρυθμιστικά διαλύματα για τη δοκιμή DΑSΙ ΕLΙSΑ 4.1. Ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, pΗ 9.6. Νa2CΟ3 1,59 g ΝaΗCΟ3 2,93 g Αποσταγμένο νερό 1.000 ml Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται το pΗ 9.6. 4.2. 10Χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα άλατος (ΡΒS), pΗ 7.2- 7.4 ΝaCl 80,0 g ΝaΗ2ΡΟ4.2 Η2Ο 4,0 g Νa2ΗΡΟ4.12Η2Ο 27,0 g Αποσταγμένο νερό 1 000 ml 4.3. ΡΒS-Τween 10Χ ΡΒS 50 ml 10% Τween 20 5 ml Αποσταγμένο νερό 950 ml 4.4. Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, pΗ 9.8. Diethanοlamine (Διαιθανολαμίνη) 100 ml Αποσταγμένο νερό 900 ml Αναμειγνύονται και ρυθμίζεται η τιμή του pΗ 9.8 με πυκνό ΗCl. Προσάρτημα 5Προσδιορισμός του επιπέδου μόλυνσης στις δοκιμές ΙF και FΙSΗ 1.Μετράται ο μέσος αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά οπτικό πεδίο (c). 2.Υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά φατνίο αντικειμενοφόρου πλάκας μικροσκοπίου (C). C = c x S/s όπου S = εμβαδόν του φατνίου μιας πολυφατνιακής αντικειμενοφόρου και s = εμβαδόν του οπτικού πεδίου του αντικειμενικού s = πi2/4G2Κ2 όπουi = συντελεστής πεδίου (κυμαίνεται από 8 έως 24 ανάλογα με τον τύπο του προσοφθαλμίου) Κ = συντελεστής σωλήνα (1 ή 1,25) G = μεγεθυντική ισχύς του αντικειμενικού φακού (100x, 40x κ.τ.λ.) 3.Υπολογίζεται ο αριθμός τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος (Ν) Ν = C x 1000/y x F όπου y = όγκος του αναδιαλυμένου ιζήματος σε κάθε φατνίο και F = συντελεστής αραίωσης του αναδιαλυμένου ιζήματος Προσάρτημα 6 Επικυρωμένα πρωτόκολλα και αντιδραστήρια ΡCR Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση 10 3 έως 10 4 κυττάρων του R. sοlanacearum ανά ml εκχυλίσματος δείγματος. Οι προκαταρκτικές δοκιμές πρέπει επίσης να μην δείχνουν οιαδήποτε λανθασμένα θετικά αποτελέσματα με ένα σύνολο επιλεγμένων στελεχών βακτηρίων (βλέπε προσάρτημα 3). 1.Πρωτόκολλο ΡCR των Seal et al. ,(1993) 1.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής ΟLΙ-1 5΄-GGG GGΤ ΑGC ΤΤG CΤΑ CCΤ GCC-3΄ Αντίστροφος εκκινητής Υ-2 5΄-CCC ΑCΤ GCΤ GCC ΤCC CGΤ ΑGG ΑGΤ-3΄ Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίου από το πρότυπο DΝΑ του R. sοlanacearum = 288 bp 1.2. Μείγμα αντίδρασης ΡCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UΡW 17,65 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα ΡCR(1) (15 mΜ ΜgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mΜ ΜgCl2) μείγμα dΝΤΡ (20mΜ) 0,25 µl 0,2 mΜ Εκκινητής ΟLΙ-1 (20 µΜ) 1,25 µl 1µΜ Εκκινητής Υ-2 (20 µΜ) 1,25 µl 1µΜ Τaq πολυμεράση (5U/µl) 1 0,1 µl 0,5 U Όγκος δείγματος 2,0 µl Συνολικός όγκος 25 µl (1) Η μέθοδος έχει επικυρωθεί με τη χρήση τηςΤaq πολυμεράσης των Ρerkin Εlmer (ΑmpliΤaq) και Gibcο ΒRL. 1.3. Συνθήκες αντίδρασης ΡCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 2 λεπτά στους 96 °C (μετουσίωση του πρότυπου DΝΑ) 35 κύκλοι από: ii) 20 δευτερόλεπτα στους 94 °C (μετουσίωση του προτύπου DΝΑ) iii) 20 δευτερόλεπτα στους 68 °C (προσκόλληση εκκινητών) iν) 30 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: ν) 10 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) νi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιήθηκε για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή Ρerkin Εlmer 9600. Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iν) για χρήση με άλλα μοντέλα. 1.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα ΡCR που έχουν ενισχυθεί από το DΝΑ του R. sοlanacearum παράγουν έναν χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Ανa ΙΙ μετά από επώαση στους 37 °C. 2.Πρωτόκολλο ΡCR των Ρastrik και Μaiss, (2000) 2.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής Ρs-1 5΄- ΑGΤ CGΑ ΑCG GCΑ GCG GGG G -3΄ Αντίστροφος εκκινητής Ρs-2 5΄- GGG GΑΤ ΤΤC ΑCΑ ΤCG GΤC ΤΤG CΑ -3΄ Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίου από το πρότυπο DΝΑ του R. sοlanacearum = 553 bp 2.2. Μείγμα αντίδρασης ΡCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UΡW 16,025 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα ΡCR(1) 2,5 µl 1x (1,5 mΜ ΜgCl2) ΒSΑ (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% μείγμα d-ΝΤΡ (20mΜ) 0,125 µl 0,1 mΜ Εκκινητής Ρs-1 (10 µΜ) 0,5 µl 0,2 µΜ Εκκινητής Ρs-2 (10 µΜ) 0,5 µl 0,2 µΜ Τaq πολυμεράση (5U/µl)(1) 0,1 µl 0,5 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl (1) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Τaq πολυμεράσης των Ρerkin Εlmer (ΑmpliΤaq) και Gibcο ΒRL. Σημείωση: Βελτιστοποιήθηκε αρχικά για τον θερμικό κυκλοποιητή ΜJ Research ΡΤC 200 με Gibcο Τaq πολυμεράση. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στις ίδιες συγκεντρώσεις η Ρerkin Εlmer ΑmpliΤaq καθώς και ρυθμιστικό διάλυμα. 2.3. Συνθήκες για την αντίδραση ΡCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 5 λεπτά στους 95 °C (μετουσίωση του πρότυπουDΝΑ) 35 κύκλοι από: ii) 30 δευτερόλεπτα στους 95 °C (μετουσίωση του πρότυπου DΝΑ) iii) 30 δευτερόλεπτα στους 68 °C (προσκόλληση εκκινητών) iν) 45 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: ν) 5 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) νi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιείται για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή ΜJ Research ΡΤC 200. Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iν) για χρήση με άλλα μοντέλα. 2.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα ΡCR που έχουν ενισχυθεί από το DΝΑ του R. sοlanacearum παράγουν έναν χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Τaq Ι μετά από επώαση στους 65 °C για 30 λεπτά. Τα θραύσματα εκ περιορισμού που αποκτώνται από το ειδικό για το R. sοlanacearum θραύσμα έχουν μέγεθος 457 bp και 96 bp. 3.Πρωτόκολλο πολλαπλής ΡCR με εσωτερικό μάρτυρα ΡCR (Ρastrik et al., 2002) 3.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής RS-1-F 5΄- ΑCΤ ΑΑC GΑΑ GCΑ GΑG ΑΤG CΑΤ ΤΑ -3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS-1-R 5΄- CCC ΑGΤ CΑC GGC ΑGΑ GΑC Τ -3΄ Πρόσθιος εκκινητής ΝS-5-F 5΄- ΑΑC ΤΤΑ ΑΑG GΑΑ ΤΤG ΑCG GΑΑ G -3΄ Αντίστροφος εκκινητής ΝS-6-R 5΄- GCΑ ΤCΑ CΑG ΑCC ΤGΤ ΤΑΤ ΤGC CΤC -3΄ Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίου από το πρότυπο DΝΑ του R. sοlanacearum = 718 bp (σετ εκκινητών RS) Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίου από εσωτερικό μάρτυρα της ΡCR 18S rRΝΑ = 310 bp (σετ εκκινητών ΝS) 3.2. Μείγμα αντίδρασης ΡCR Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UΡW 12,625 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα ΡCR(1) (15 mΜ ΜgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mΜ ΜgCl2) ΒSΑ (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% μείγμα d-ΝΤΡ (20mΜ) 0,125 µl 0,1 mΜ Εκκινητής RS-1-F (10µΜ) 2,0 µl 0,8 µΜ Εκκινητής RS-1-R (10µΜ) 2,0 µl 0,8 µΜ Εκκινητής ΝS-5-F (10µΜ)(2) 0,15 µl 0,06 µΜ Εκκινητής ΝS-6-R (10µΜ)(2) 0,15 µl 0,06 µΜ Τaq πολυμεράση (5U/µl)(1) 0,2 µl 1,0 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl (1) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Τaq πολυμεράσης των Ρerkin Εlmer (ΑmpliΤaq) και Gibcο ΒRL. (2) Η συγκέντρωση των εκκινητών ΝS-5-F και ΝS-6-R βελτιστοποιήθηκε για το εκχύλισμα κώνου από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου πατάτας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ομοιογενοποίησης και τον καθαρισμό DΝΑ σύμφωνα με τον Ρastrik (2000) (βλέπε ενότητα VΙ.Α.6.1.α.). Η επαναβελτιστοποίηση των συγκεντρώσεων αντιδραστηρίων απαιτείται εάν χρησιμοποιηθεί η εξαγωγή με ανάδευση ή άλλη μέθοδο απομόνωσης του DΝΑ. 3.3. Συνθήκες για την αντίδραση ΡCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα: 1 κύκλος από: i) 5 λεπτά στους 95 °C (μετουσίωση του προτύπου DΝΑ) 35 κύκλοι από: ii) 30 δευτερόλεπτα στους 95 °C (μετουσίωση του προτύπου DΝΑ) iii) 30 δευτερόλεπτα στους 58 °C (προσκόλληση εκκινητών) iν) 45 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: ν) 5 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) νi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιείται για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή ΜJ Research ΡΤC 200. Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iν) για χρήση με άλλα μοντέλα. 3.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα ΡCR που έχουν ενισχυθεί από το DΝΑ του R. sοlanacearum παράγουν έναν χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Βsm Ι ή ένα ισοσχιζομερές (π.χ. Μνa 1269 Ι) μετά από επώαση στους 65 °C για 30 λεπτά. 4.Πρωτόκολλο ΡCR εξειδικευμένο για βιοποικιλίες του R. sοlanacearum (Ρastrik et al, 2001) 4.1. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων Πρόσθιος εκκινητής RS-1-F 5΄- ΑCΤ ΑΑC GΑΑ GCΑ GΑG ΑΤG CΑΤ ΤΑ -3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS-1-R 5΄- CCC ΑGΤ CΑC GGC ΑGΑ GΑC Τ -3΄ Αντίστροφος εκκινητής RS-3-R 5΄- ΤΤC ΑCG GCΑ ΑGΑ ΤCG CΤC -3΄ Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίου από το πρότυπο DΝΑ του R. sοlanacearum: με RS-1-F/RS-1-R = 718 bp με RS-1-F/RS-3-R = 716 bp 4.2. Μείγμα αντίδρασης ΡCR 1)ΡCR ειδική για τη βιοποικιλία 1/2 Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UΡW 12,925 µl 10x ρυθμιστικό διάλυμα ΡCR(1) 2,5 µl 1x (1,5 mΜ ΜgCl2) ΒSΑ (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% Μείγμα d-ΝΤΡ (20mΜ) 0,125 µl 0,1 mΜ Εκκινητής RS-1-F (10 µΜ) 2 µl 0,8 µΜ Εκκινητής RS-1-R (10 µΜ) 2 µl 0,8 µΜ Τaq πολυμεράση (5U/µl)(1) 0,2 µl 1 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl (1) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Τaq πολυμεράσης των Ρerkin Εlmer (ΑmpliΤaq) και Gibcο ΒRL. 2)ΡCR ειδική για τη βιοποικιλία 3/4/5 Αντιδραστήριο Ποσότητα ανά αντίδραση Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο UΡW 14,925 µl 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα ΡCR(1) 2,5 µl 1x (1,5 mΜ ΜgCl2) ΒSΑ (κλάσμα V) (10%) 0,25 µl 0,1% μείγμα d-ΝΤΡ (20mΜ) 0,125 µl 0,1 mΜ Εκκινητής RS-1-F (10 µΜ) 1 µl 0,4 µΜ Εκκινητής RS-3-R (10 µΜ) 1 µl 0,4 µΜ Τaq πολυμεράση (5U/µl)(1) 0,2 µl 1 U Όγκος δείγματος 5,0 µl Συνολικός όγκος 25,0 µl (1) Οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί με τη χρήση της Τaq πολυμεράσης των Ρerkin Εlmer (ΑmpliΤaq) και Gibcο ΒRL. 4.3. Συνθήκες για την αντίδραση ΡCR Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα για τις αντιδράσεις που είναι ειδικές για τη βιοποικιλία 1/2 και τη βιοποικιλία 3/4/5: 1 κύκλος από: i) 5 λεπτά στους 95 °C (μετουσίωση του προτύπου DΝΑ) 35 κύκλοι από: ii) 30 δευτερόλεπτα στους 95 °C (μετουσίωση του προτύπου DΝΑ) iii) 30 δευτερόλεπτα στους 58 °C (προσκόλληση εκκινητών) iν) 45 δευτερόλεπτα στους 72 °C (επέκταση αντιγράφου) 1 κύκλος από: ν) 5 λεπτά στους 72 °C (τελική επέκταση) νi) διατήρηση στους 4 °C Σημείωση: Το πρόγραμμα αυτό βελτιστοποιήθηκε για χρήση με θερμικό κυκλοποιητή ΜJ Research ΡΤC 200. Ενδέχεται να απαιτηθεί τροποποίηση της διάρκειας των βημάτων των κύκλων ii), iii) και iν) για χρήση με άλλα μοντέλα. 4.4. Ανάλυση του αμπλικονίου με ένζυμο περιορισμού Τα προϊόντα ΡCR που έχουν ενισχυθεί από το DΝΑ του R. sοlanacearum χρησιμοποιώντας εκκινητές RS-1-F και RS-1-R παράγουν ένα χαρακτηριστικό πολυμορφισμό μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού με το ένζυμο Βsm Ι ή ένα ισοσχιζομερές (π.χ. Μνa 1269 Ι) μετά από επώαση στους 65 °C για 30 λεπτά. Τα προϊόντα ΡCR που έχουν ενισχυθεί από το DΝΑ του R. sοlanacearum χρησιμοποιώντας εκκινητές RS-1-F και RS-3-R δεν έχουν εστίες περιορισμού. 5.Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης 5.1. Βrοmοphenοl blue (10% πυκνό διάλυμα) Βrοmοphenοl blue 5 g Αποσταγμένο νερό (διπλά αποσταγμένο) 50 ml 5.2. Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Γλυκερίνη (86%) 3,5 ml Βrοmοphenοl blue (5.1) 300 µl Αποσταγμένο νερό (διπλά αποσταγμένο) 6,2 ml 6.10Χ Τris Αcetate ΕDΤΑ (ΤΑΕ) ρυθμιστικό διάλυμα, pΗ 8.0 Ρυθμιστικό διάλυμα Τris 48,40 g Κρυσταλλικό οξικό οξύ 11,42 ml ΕDΤΑ (disοdium salt) 3,72 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύεται σε 1Χ πριν τη χρήση. Διατίθεται επίσης στο εμπόριο (π.χ. Ιnνitrοgen ή ισοδύναμο). Προσάρτημα 7 Επικυρωμένα αντιδραστήρια για τη δοκιμή FΙSΗ 1.Ολιγοανιχνευτέςανιχνευτής ΟLΙ-1-CΥ3 ειδικός για το R. sοlanacearum: 5΄- GGC ΑGG ΤΑG CΑΑ GCΤ ΑCC CCC-3΄ Μη εξειδικευμένος ανιχνευτής ευβακτηρίου ΕUΒ-338-FΙΤC: 5΄- GCΤ GCC ΤCC CGΤ ΑGG ΑGΤ -3΄ 2.Προσηλωτικό διάλυμα [ΠΡΟΣΟΧΗ! ΤΟ ΠΡΟΣΗΛΩΤΙΚΟ ΥΓΡΟ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΠΑΡΑΦΟΡΜΑΛΔΕΫΔΗ Η ΟΠΟΙΑ ΕΙΝΑΙ ΤΟΞΙΚΗ. ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΦΟΡΟΥΝΤΑΙ ΓΑΝΤΙΑ ΚΑΙ ΝΑ ΜΗΝ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΕΙΣΠΝΟΕΣ. ΣΥΝΙΣΤΑΤΑΙ Η ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΕ ΑΠΑΓΩΓΟ] i) Θερμαίνονται 9 ml ύδατος μοριακού βαθμού καθαρότητας [π.χ. υπέρ καθαρό νερό (UΡW)] σε περίπου 60 °C και προστίθενται 0,4 g παραφορμαλδεΰδης. Η παραφορμαλδεΰδη διαλύεται μετά την προσθήκη 5 σταγόνων 1Ν ΝaΟΗ και ανάδευση με μαγνητικό αναδευτήρα. ii) Το pΗ ρυθμίζεται στην τιμή 7.0 με την προσθήκη 1ml 0,1Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ΡΒ· pΗ 7.0) και 5 σταγόνων 1Ν ΗCl. Ελέγχεται το pΗ με ταινίες δεικτών και προσαρμόζεται εάν είναι απαραίτητο με ΗCl ή ΝaΟΗ. [ΠΡΟΣΟΧΗ! ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΠΕΧΑΜΕΤΡΟ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΜΕ ΠΑΡΑΦΟΡΜΑΛΔΕΫΔΗ] iii) Το διάλυμα φιλτράρεται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,22 µm και διατηρείται απαλλαγμένο από σκόνη στους 4 °C έως ότου ξαναχρησιμοποιηθεί. 3.3Χ Ηybmix ΝaCl 2,7 Μ Τris-ΗCl 60 mΜ (pΗ 7.4) ΕDΤΑ (αποστειρωμένο με διήθηση από 15 mΜ φίλτρο και σε αυτόκαυστο) Αραιώνεται σε 1Χ όπως απαιτείται. 4.Διάλυμα υβριδισμού 1Χ Ηybmix Sοdium dοdecyl sulphate (SDS) 0,01%Fοrmamide (φορμαμίδη) 30%ανιχνευτής ΕUΒ 338 5 ng/µl ανιχνευτής ΟLΙ-1 ή ΟLΙ-2 5 ng/µl Παρασκευάζονται ποσότητες διαλύματος υβριδισμού σύμφωνα με τους υπολογισμούς του πίνακα 1. Για κάθε αντικειμενοφόρο (που περιλαμβάνει 2 διαφορετικά δείγματα εις διπλούν) απαιτούνται 90 µl διαλύματος υβριδισμού. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η ΦΟΡΜΑΜΙΔΗ ΕΙΝΑΙ ΠΟΛΥ ΤΟΞΙΚΗ ΚΑΙ ΓΙΑ ΤΟ ΛΟΓΟ ΑΥΤΟ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΑΝΤΙΑ ΚΑΙ ΝΑ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΟΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΕΣ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ! Πίνακας 1: Συνιστώμενες ποσότητες για την παρασκευή του μείγματος υβριδισμού Αριθμός αντικειμενοφόρων: 1 4 6 8 10 Αποστειρωμένο UΡW 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0 3x hybmix 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0 1% SDS 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0 Fοrmamide (φορμαμίδη) 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0 Ανιχνευτής ΕUΒ 338 (100 ng/µl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Ανιχνευτής ΟLΙ-1 ή ΟLΙ-2 (100 ng/µl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 Συνολικός όγκος (µl) 90,0 360,0 540,0 720,0 900,0 Σημείωση: Όλα τα διαλύματα που περιέχουν φωτοευαίσθητους ολιγοανιχνευτές αποθηκεύονται στο σκοτάδι στους -20 °C. Προστατεύονται από το άμεσο φως του ηλίου ή το ηλεκτρικό φως κατά τη χρήση. 5.0,1Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pΗ 7.0 Νa2ΗΡΟ4 8,52 g ΚΗ2ΡΟ4 5,44 g Αποσταγμένο νερό 1,00 L Διαλύονται τα συστατικά, ελέγχεται η τιμή του pΗ και το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους121 °C επί 15 λεπτά. Προσάρτημα 8 Καλλιέργεια μελιτζάνας και τομάτας Σπόροι τομάτας (Lycοpersicοn esculentum) ή μελιτζάνας (Sοlanum melοngena) σπέρνονται σε παστεριωμένο υπόστρωμα. Μετά την πλήρη έκπτυξη των κοτυληδόνων (10-14 ημέρες), τα σπορόφυτα μεταφυτεύονται σε γλάστρες με παστεριωμένο υπόστρωμα. Τα φυτά μελιτζάνας ή τομάτας πρέπει να καλλιεργούνται σε θερμοκήπιο με τις ακόλουθες περιβαλλοντικές συνθήκες πριν από την τεχνητή μόλυνση: Μήκος ημέρας: 14 ώρες ή φυσικό μήκος ημέρας, αν είναι μεγαλύτερο Θερμοκρασία: ημέρα: 21 έως 24 °C, νύχτα: 14 έως 18 °C. Ευπαθής ποικιλία τομάτας: «Μοneymaker» Ευπαθής ποικιλία μελιτζάνας:«Βlack Βeauty» Προμηθευτές: βλέπε ιστοχώρο http:ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ1.Αmann, R.Ι., L. Κrumhοlz and D.Α. Stahl. 1990. Fluοrescent-οligοnucleοtide prοbing οf whοle cells fοr determinatiνe, phylοgenetic and enνirοnmental studies in micrοbiοlοgy. J. Βacteriοl. 172: 762-770. 2.Αnοn. 1998. Οδηγία 98/57/ΕΚ του Συμβουλίου, της 20ής Ιουλίου 1998, για τον έλεγχο του Ralstοnia sοlanacearum (Smith) Υabuuchi et al. Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων L235, 1-39. 3.Βοudazin, G., Α.C. Le Rοux, Κ. Jοsi, Ρ. Labarre and Β. Jοuan. 1999. Design οf diνisiοn specific primers οf Ralstοnia sοlanacearum and applicatiοn tο the identificatiοn οf Εurοpean isοlates. Εurοpean Jοurnal οf Ρlant Ρathοlοgy 105: 373-380. 4.Carusο, Ρ., Gοrris, Μ.Τ., Cambra, Μ., Ρalοmο, J. L., Cοllar, J and Lοpez, Μ.Μ. 2002. Εnrichment Dοuble-Αntibοdy Sandwich Ιndirect Εnzyme-Linked Ιmmunοsοrbent Αssay Τhat Uses a Specific Μοnοclοnal Αntibοdy fοr sensitiνe Detectiοn οf Ralstοnia sοlanacearum in Αsymptοmatic Ροtatο Τubers. Αpplied and Εnνirοnmental Μicrοbiοlοgy 68: 3634-3638. 5.Cοοk, D., Βarlοw, Ε. and Sequeira, L. 1989. Genetic diνersity οf Ρseudοmοnas sοlanacearum: detectiοn οf restrictiοn fragment length pοlymοrphisms with DΝΑ prοbes that specify νirulence and the hypersensitiνe respοnse. Μοlecular Ρlant-Μicrοbe Ιnteractiοns 1: 113-121. 6.Εlphinstοne, J. G., Ηennessy, J., Wilsοn, J. Κ. and Stead, D. Ε. 1996. Sensitiνity οf detectiοn οf Ralstοnia sοlanacearum in pοtatο tuber extracts. ΕΡΡΟ Βulletin 26: 663-678. 7.Εnglebrecht, Μ. C. (1994) Μοdificatiοn οf a semi-selectiνe medium fοr the isοlatiοn and quantificatiοn οf Ρseudοmοnas sοlanacearum. Ιn: Α. C. Ηayward (ed.) Βacterial Wilt Νewsletter 10, 3-5. Αustralian Centre fοr Ιnternatiοnal Αgricultural Research, Canberra, Αustralia. 8.Ηayward, Α.C., 1964. Characteristics οf Ρseudοmοnas sοlanacearum. Jοurnal οf Αpplied Βacteriοlοgy 27: 265-277. 9.Ηayward, Α.C., Εl-Νashaar, Η.Μ., Νydegger, U. and De Lindο, L. 1990. Variatiοn in nitrate metabοlism in biονars οf Ρseudοmοnas sοlanacearum. Jοurnal οf Αpplied Βacteriοlοgy 69: 269-280. 10.Ιtο, S., Υ. Ushijima, Τ. Fujii, S. Τanaka, Μ. Κameya-Ιwaki, S. Υοshiwara and F. Κishi. 1998. Detectiοn οf νiable cells οf Ralstοnia sοlanacearum in sοil using a semi-selectiνe medium and a ΡCR technique. J. Ρhytοpathοlοgy 146: 379-384. 11.Janse, J. D. (1988) Α detectiοn methοd fοr Ρseudοmοnas sοlanacearum in symptοmless pοtatο tubers and sοme data οn its sensitiνity and specificity. Βulletin ΟΕΡΡ/ΕΡΡΟ Βulletin 18: 343-351. 12.Janse, J.D. 1991. Ιnfra- and intra-specific classificatiοn οf Ρseudοmοnas sοlanacaerum strains using whοle cell fatty-acid analysis. Systematic and Αpplied Μicrοbiοlοgy 14: 335-345. 13.Κelman, Α. 1954. Τhe relatiοnship οf pathοgenicity οf Ρseudοmοnas sοlanacearum tο cοlοny appearance οn a tetrazοlium medium. Ρhytοpathοlοgy 44: 693-695. 14.Κlement Ζ.· Rudοlph, Κ and D. C. Sands, 1990. Μethοds in Ρhytοbacteriοlοgy. Αkadιmiai Κiadσ, Βudapest, 568 pp. 15.Lelliοtt, R.Α. and Stead, D.Ε. 1987. Μethοds fοr the diagnοsis οf bacterial diseases οf plants. Βlackwell scientific Ρublicatiοns Ltd., Οxfοrd. 216 pp. 16.Lοpez, Μ.Μ., Gοrris, Μ.Τ., Llοp, Ρ., Cuberο, J., Vicedο, Β., Cambra, Μ., 1997. Selectiνe enrichment imprονes selectiνe isοlatiοn, serοlοgical and mοlecular detectiοn οf plant pathοgenic bacteria. Ιn: Η.W. Dehne et al., (eds). Κlewer Αcademic Ρublishers. pp. 117-121. 17.Lοuws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.Τ. and De Βruijn, F.J., 1994. Specific genοmic fingerprints οf phytοpathοgenic Χanthοmοnas and Ρseudοmοnas pathονars and strains generated with repetitiνe sequences and ΡCR. Αpplied and Εnνirοnmental Μicrοbiοlοgy, 60: 2286-2295 18.Lοuws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.Τ. and De Βruijn, F.J. 1995. Differentiatiοn οf genοmic structure by rep-ΡCR fingerprinting tο rapidly classify Χanthοmοnas campestris pν. νesicatοria. Ρhytοpathοlοgy 85: 528-536. 19.Οpina, Ν., F. Τaνner, G. Ηοllοway, J.-F Wang, Τ.-Η Li, R. Μaghirang, Μ. Fegan, Α. C. Ηayward, V. Κrishnapillai, W.F. Ηοng, Β.W. Ηοllοway, J.Ν.Τimmis. 1997. Α nονel methοd fοr deνelοpment οf species and strain-specific DΝΑ prοbes and ΡCR primers fοr identifying Βurkhοlderia sοlanacearum (fοrmerly Ρseudοmοnas sοlanacearum). Αs Ρac. J. Μοl. Βiοl. Βiοtechnοl. 5: 19-33. 20.Ρastrik, Κ.Η. and Μaiss, Ε. 2000. Detectiοn οf R. sοlanacearum in pοtatο tubers by pοlymerase chain reactiοn. J. Ρhytοpathοlοgy 148: 619-626. 21.Ρastrik, Κ. Η., Εlphinstοne, J.G. and Ρukall, R. 2002. Sequence analysis and detectiοn οf Ralstοnia sοlanacearum by multiplex ΡCR amplificatiοn οf 16S-23S ribοsοmal intergenic spacer regiοn with internal pοsitiνe cοntrοl. Εurοpean Jοurnal οf Ρlant Ρathοlοgy 108: 831-842. 22.Rοbinsοn-Smith, Α., Jοnes, Ρ., Εlphinstοne, J. G. and Fοrde, S.Μ.D. (1995) Ρrοductiοn οf antibοdies tο Ρseudοmοnas sοlanacearum, the causatiνe agent οf bacterial wilt. Fοοd and Αgricultural Ιmmunοlοgy 7: 67-79. 23.Schaad, W. 2001. Labοratοry guide fοr identificatiοn οf plant pathοgenic bacteria. Schaad [Ηrsg.]. - 3. ed.· St. Ρaul, Μinnesοta:, 373 pp 24.Seal, S.Ε., L.Α. Jacksοn, J.Ρ.W.Υοung, and Μ.J.Daniels. 1993. Detectiοn οf Ρseudοmοnas sοlanacearum, Ρseudοmοnas syzygii, Ρseudοmοnas pickettii and Βlοοd Disease Βacterium by partial 16S rRΝΑ sequencing: cοnstructiοn οf οligοnucleοtide primers fοr sensitiνe detectiοn by pοlymerase chain reactiοn. J. Gen. Μicrοbiοl. 139: 1587-1594. 25.Smith, J.J., Οffοrd, L.C., Ηοlderness, Μ. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diνersity οf Βurkhοlderia sοlanacearum (synοnym Ρseudοmοnas sοlanacearum) race 3 in Κenya. Αpplied and Εnνirοnmental Μicrοbiοlοgy 61: 4262-4268. 26.Stead, D.Ε. 1992. Grοuping οf plant pathοgenic and sοme οther Ρseudοmοnas spp. using cellular fatty-acid prοfiles. Ιnternatiοnal Jοurnal οf Systematic Βacteriοlοgy 42: 281-295. 27.Τaghaνi, Μ., Ηayward, Α.C., Sly, L.Ι., Fegan, Μ. 1996. Αnalysiss οf the phylοgenetic relatiοnships οf strains οf Βurkhοlderia sοlanacearum, Ρseudοmοnas syzygii, and the blοοd disease bacterium οf banana based οn 16S rRΝΑ gene sequences. Ιnternatiοnal Jοurnal οf Systematic Βacteriοlοgy 46: 10-15. 28.Van Der Wοlf, J. Μ., Βοnants, Ρ.J.Μ., Smith, J.J., Ηagenaar, Μ., Νijhuis, Ε., Van Βeckhονen, J.R.C., Saddler, G.S., Τrigalet, Α., Feuillade, R. 1998. Genetic diνersity οf Ralstοnia sοlanacearum Race 3 in Western Εurοpe as determined by ΑFLΡ, RC-ΡFGΕ and rep-ΡCR. Ιn: Ρriοr, Ρ., Αllen, C. and Εlphinstοne, J. (eds.) Βacterial wilt disease: Μοlecular and Εcοlοgical Αspects. Springer (Βerlin) pp. 44-49. 29.Weller, S.Α., Εlphinstοne, J.G., Smith, Ν., Stead, D.Ε. and Βοοnham, Ν. 1999. Detectiοn οf Ralstοnia sοlanacearum strains using an autοmated and quantitatiνe flοurοgenic 5’ nuclease ΤaqΜan assay. Αpplied and Εnνirοnmental Μicrοbiοlοgy 66: 2853-2858. 30.Wullings, Β.Α., Α.R. νan Βeuningen, J.D. Janse and Α.D.L.Αkkermans. 1998. Detectiοn οf Ralstοnia sοlanacearum , which causes brοwn rοt οf pοtatο, by fluοrescent in situ hybridizatiοn with 23s rRΝΑ-targeted prοbes. Αppl. Εnνirοn. Μicrοbiοl. 64: 4546-4554. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ 1.Για κάθε πιθανολογούμενη παρουσία για την οποία υπάρχει θετικό αποτέλεσμα στη (στις) δοκιμή(-ές) διαλογής, σύμφωνα με τις σχετικές μεθόδους που ορίζονται στο παράρτημα ΙΙ για το αναφερόμενο φυτικό υλικό και για άλλες περιπτώσεις, και για την οποία αναμένεται επιβεβαίωση ή διάψευση με την ολοκλήρωση των εν λόγω μεθόδων, παρακρατούνται και φυλάσσονται κατάλληλα: – όλοι οι κόνδυλοι του δείγματος και, όταν είναι εφικτό, όλα τα φυτά της δειγματοληψίας, – κάθε εναπομένον εκχύλισμα και πρόσθετο υλικό που παρασκευάσθηκε για την ή τις δοκιμές διαλογής, π.χ. αντικειμενοφόροι πλάκες ανοσοφθορισμού, και– όλη η σχετική τεκμηρίωση, μέχρι την ολοκλήρωση των εν λόγω μεθόδων. Η παρακράτηση των κονδύλων θα καταστήσει δυνατή τη διεξαγωγή δοκιμών ποικιλιών όπου αυτό ενδείκνυται. 2.Σε περίπτωση θετικής επιβεβαίωσης του οργανισμού, παρακρατείται και φυλάσσεται κατάλληλα: – το υλικό που αναφέρεται στην παράγραφο 1, και– δείγμα του μολυσμένου υλικού τομάτας ή μελιτζάνας το οποίο έχει μολυνθεί τεχνητά με εκχύλισμα κονδύλου ή φυτού, όπου αυτό ενδείκνυται, και– η απομονωμένη καλλιέργεια του οργανισμού για τουλάχιστον ένα μήνα μετά τη διαδικασία κοινοποίησης του άρθρου 5 παράγραφος 2 του παρόντος. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙV Τα στοιχεία των ελέγχων που αναφέρονται στο άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο i) του παρόντος περιλαμβάνουν κατά περίπτωση: (i) τους τόπους παραγωγής, – όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες που έχουν κλωνική σχέση με τις μολυσμένες από τον οργανισμό πατάτες, – όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί τομάτες που έχουν την ίδια προέλευση με τις μολυσμένες από τον οργανισμό τομάτες, – όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες ή τομάτες οι οποίες υπόκεινται σε επίσημο έλεγχο λόγω της πιθανολογούμενης εμφάνισης του οργανισμού, – όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες που έχουν κλωνική σχέση με πατάτες που καλλιεργούνται σε μολυσμένους από τον οργανισμό τόπους, – όπου καλλιεργούνται πατάτες ή τομάτες, οι οποίες γειτνιάζουν με μολυσμένους τόπους παραγωγής, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που χρησιμοποιούν τον ίδιο εξοπλισμό και εγκαταστάσεις παραγωγής απευθείας ή μέσω κοινού αναδόχου, – που χρησιμοποιούν επιφανειακό νερό για άρδευση ή ψεκασμό από πηγές για τις οποίες έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχουν μολυνθεί από τον οργανισμό, – που χρησιμοποιούν επιφανειακό νερό για άρδευση ή ψεκασμό από πηγή που χρησιμοποιείται από κοινού με τόπους παραγωγής για τους οποίους έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχουν μολυνθεί από τον οργανισμό, – που πλημμυρίζουν ή έχουν πλημμυρίσει με επιφανειακό νερό για το οποίο έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχει μολυνθεί από τον οργανισμό, και(ii) το επιφανειακό νερό το οποίο χρησιμοποιήθηκε για άρδευση ή ψεκασμό ή το οποίο έχει πλημμυρίσει αγρούς ή τόπους παραγωγής οι οποίοι επιβεβαιώθηκαν να είναι μολυσμένοι από τον οργανισμό. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V 1.Τα στοιχεία που λαμβάνονται υπόψη στον προσδιορισμό της έκτασης της πιθανής μόλυνσης βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iii) του παρόντος και του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο iii) του παρόντος περιλαμβάνουν, κατά περίπτωση: – το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που παράγεται σε τόπο παραγωγής χαρακτηρισμένο ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος, – τον (ή τους) τόπο(-ους) παραγωγής που έχει κάποιο δεσμό παραγωγής με το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μοιράζονται τον εξοπλισμό και εγκαταστάσεις παραγωγής απευθείας ή μέσω κοινού αναδόχου, – το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που παράγεται στον ή τους τόπους παραγωγής που αναφέρονται στην προηγούμενη περίπτωση, ή που υπήρχε στον ή τους τόπους παραγωγής κατά την ίδια περίοδο κατά την οποία το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που χαρακτηρίστηκε ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος υπήρχε στους τόπους παραγωγής που αναφέρονται στην πρώτη περίπτωση, – τις εγκαταστάσεις όπου διακινείται το καταχωρισμένο φυτικό υλικό προέλευσης των ανωτέρω τόπων παραγωγής, – κάθε μηχάνημα, όχημα, περιέκτης, αποθήκη ή μονάδα αυτών και κάθε άλλο αντικείμενο, συμπεριλαμβανομένων των υλικών συσκευασίας, που ενδέχεται να έχουν έλθει σε επαφή με το καταχωρισμένο φυτικό υλικό χαρακτηρισμένο ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος, – κάθε καταχωρισμένο φυτικό υλικό που έχει αποθηκευτεί ή ήλθε σε επαφή, με οποιαδήποτε κατασκευή ή αντικείμενα που απαριθμούνται στην προηγούμενη περίπτωση, πριν από τον καθαρισμό και την απολύμανση αυτών των κατασκευών και αντικειμένων, – βάσει των αποτελεσμάτων των ελέγχων και των δοκιμών που διενεργούνται σύμφωνα με το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο i) του παρόντος για τις πατάτες, εκείνους τους κονδύλους ή φυτά με αδελφική ή γονική κλωνική σχέση, και, για τις τομάτες, εκείνα τα φυτά της ίδιας προέλευσης, με το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που χαρακτηρίστηκε ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος και τα οποία, μολονότι ενδέχεται να έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα κατά τις δοκιμές ανίχνευσης του οργανισμού, φαίνεται ότι είναι πιθανή η μόλυνση μέσω κλωνικής σχέσης. Δοκιμή ποικιλιών μπορεί να αναληφθεί για την επαλήθευση της ταυτότητας των μολυσμένων και κλωνικά σχετιζόμενων κονδύλων ή φυτών, – τον ή τους τόπους παραγωγής του καταχωρισμένου φυτικού υλικού που αναφέρεται στην προηγούμενη περίπτωση, – τον ή τους τόπους παραγωγής καταχωρισμένου φυτικού υλικού που χρησιμοποιούν νερό για άρδευση ή ψεκασμό το οποίο έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο ii) του παρόντος, – το καταχωρισμένο φυτικό υλικό που έχει παραχθεί σε αγρούς οι οποίοι έχουν πλημμυρίσει με επιφανειακό νερό το οποίο έχει επιβεβαιωθεί ότι έχει μολυνθεί. 2.Τα στοιχεία που λαμβάνονται υπόψη στον προσδιορισμό της πιθανής μετάδοσης που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iν) του παρόντος και το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο iii) του παρόντος περιλαμβάνουν: i) στις περιπτώσεις βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iν) του παρόντος: – τη γειτνίαση άλλων τόπων παραγωγής όπου καλλιεργείται το καταχωρισμένο φυτικό υλικό, – τη συνήθη παραγωγή και χρησιμοποίηση του αποθέματος πατατόσπορου, – τους τόπους παραγωγής που χρησιμοποιούν επιφανειακό νερό για άρδευση ή ψεκασμό του καταχωρισμένου φυτικού υλικού σε περιπτώσεις κατά τις οποίες υπάρχει ή υπήρξε κίνδυνος απορροών επιφανειακού νερού από καλλιεργήσιμα εδάφη που έχουν χαρακτηρισθεί ως μολυσμένα βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος ή πλημμύρας των εδαφών αυτών από επιφανειακό νερό, ii) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το επιφανειακό νερό χαρακτηρίστηκε ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο ii) του παρόντος: – τον ή τους τόπους παραγωγής του καταχωρισμένου φυτικού υλικού που γειτνιάζουν ή που υπάρχει κίνδυνος να πλημμυρίσουν με επιφανειακό νερό χαρακτηρισμένο ως μολυσμένο, – οποιαδήποτε διακριτή λεκάνη άρδευσης που συνδέεται με το επιφανειακό νερό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, – ύδατα που συνδέονται με το επιφανειακό νερό που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, λαμβάνοντας υπόψη: - την κατεύθυνση και το ρυθμό ροής του νερού που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο, - την παρουσία άγριων σολανωδών φυτών ξενιστών. 3.Η κοινοποίηση που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 2 πρώτο εδάφιο του παρόντος παρέχεται ως εξής: – αμέσως μετά την επιβεβαίωση της παρουσίας του οργανισμού μέσω εργαστηριακών δοκιμών, κάνοντας χρήση των μεθόδων που παρατίθενται στο παράρτημα ΙΙ, τουλάχιστον: – όσον αφορά τις πατάτες, 1)την ονομασία της ποικιλίας της παρτίδας, 2)τον τύπο [πατάτες εμπορίου (ware), πατατόσπορος, κ.τ.λ.] και, όπου ενδείκνυται, την κατηγορία του πατατόσπορου, – όσον αφορά τα φυτά τομάτας, την ονομασία της ποικιλίας της παρτίδας και, όπου είναι σκόπιμο, την κατηγορία, – με την επιφύλαξη των απαιτήσεων κοινοποίησης πιθανολογούμενης εμφάνισης του άρθρου 4 παράγραφος 3 του παρόντος, η Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, στην περίπτωση επιβεβαίωσης της εμφάνισης, κοινοποιεί αμέσως στο(-α) ενδιαφερόμενο(-α) κράτος(-η) μέλος(-η), όταν υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης καταχωρισμένου φυτικού υλικού από άλλο(-α) κράτος(-η) μέλος(-η) ή εντός αυτού(-ών), τις πληροφορίες που απαιτούνται για τη συμμόρφωσή του με το άρθρο 5 παράγραφος 3 του παρόντος, όπως: 1)την ονομασία της ποικιλίας της παρτίδας πατάτας ή τομάτας, 2)το ονοματεπώνυμο και τη διεύθυνση του αποστολέα και του παραλήπτη, 5)την ημερομηνία παραλαβής της παρτίδας πατάτας ή τομάτας, 6)το μέγεθος της παρτίδας πατάτας ή τομάτας που παραλήφθηκε, 7)αντίγραφο του φυτοϋγειονομικού διαβατηρίου ή τουλάχιστον τον αριθμό του φυτοϋγειονομικού διαβατηρίου όπου χρειάζεται ή τον αριθμό μητρώου του καλλιεργητή ή εμπόρου όπου χρειάζεται και αντίγραφο του εμπορικού εγγράφου παράδοσης (π.χ. δελτίο αποστολής ή φορτωτική). Η Επιτροπή πρέπει να ενημερώνεται αμέσως όταν έχει παρασχεθεί τέτοια πληροφόρηση. 4.Οι λεπτομέρειες της πρόσθετης κοινοποίησης που αναφέρεται στο άρθρο 5 παράγραφος 2 δεύτερο εδάφιο του παρόντος παρέχονται ως ακολούθως: μετά την ολοκλήρωση όλων των ερευνών, για κάθε περίπτωση: 1)την ημερομηνία που επιβεβαιώθηκε η μόλυνση, 2)σύντομη περιγραφή της έρευνας που έλαβε χώρα για την ταυτοποίηση της πηγής και την ενδεχόμενη επέκταση της μόλυνσης, συμπεριλαμβανομένου του επιπέδου της δειγματοληψίας που πραγματοποιήθηκε, 3)πληροφορίες σχετικά με την(-ις) ταυτοποιημένη(-ες) ή πιθανή(-ές) πηγή(-ές) μόλυνσης, 4)λεπτομέρειες σχετικά με την έκταση της προσδιορισθείσας μόλυνσης, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού χώρων παραγωγής και για πατάτες τον αριθμό παρτίδων με ένδειξη της ποικιλίας και, στην περίπτωση πατατόσπορου, της κατηγορίας, 5)λεπτομέρειες της οριοθέτησης ζώνης, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των περιοχών παραγωγής, που δεν έχουν χαρακτηρισθεί ως μολυσμένες, αλλά συμπεριλαμβάνονται στη ζώνη, 6)λεπτομέρειες σχετικά με το χαρακτηρισμό των υδάτων, στις οποίες συμπεριλαμβάνονται η ονομασία και η τοποθεσία της υδάτινης μάζας και η έκταση του χαρακτηρισμού /της απαγόρευσης άρδευσης, 7)για κάθε αποστολή φυτών ή παρτίδα τομάτας που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένη, τα πιστοποιητικά που ορίζονται στο άρθρο 15 παράγραφος 1 σημείο ii) του Π.Δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως αντικαταστάθηκε από το άρθρο 2 παράγραφος 8α) του Π.Δ. 179/2005 (Α΄ 229) και τον αριθμό διαβατηρίου, σύμφωνα με τον κατάλογο του παραρτήματος V, μέρος Α, κεφάλαιο Ι σημείο 2.2 του Π.Δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει, 8)οποιαδήποτε άλλη πληροφορία σχετική με την(-τις) επιβεβαιωμένη(-μένες) εμφάνιση(-νήσεις) του εν λόγω επιβλαβούς οργανισμού, που απαιτεί η Επιτροπή. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VΙ 1.Οι διατάξεις που αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 1 του παρόντος, είναι οι εξής: – χρήση ως ζωοτροφή ύστερα από θερμική επεξεργασία ώστε να μην υπάρχει κίνδυνος επιβίωσης του οργανισμού, ή– διάθεση σε επισήμως εγκεκριμένη ειδική τοποθεσία διάθεσης αποβλήτων στην οποία δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διαφυγής του οργανισμού στο περιβάλλον, μέσω π.χ. διήθησης σε γεωργικά εδάφη ή επαφής με πηγές νερού που μπορούν να χρησιμοποιούνται για άρδευση γεωργικών εδαφών ή– καύση, ή– βιομηχανική μεταποίηση μέσω απευθείας και άμεσης παράδοσης σε μεταποιητική μονάδα με επισήμως εγκεκριμένες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων για τις οποίες έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού και με σύστημα καθαρισμού και απολύμανσης τουλάχιστον των αναχωρούντων οχημάτων, ή– άλλα μέτρα, με την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού· τα μέτρα αυτά και η αιτιολόγησή τους κοινοποιούνται αμέσως στην Επιτροπή και στις αρμόδιες αρχές των άλλων κρατών μελών από τη Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων. Όλα τα εναπομείναντα απόβλητα που σχετίζονται και προκύπτουν από τις ανωτέρω επιλογές διατίθενται με επισήμως εγκεκριμένες μεθόδους σύμφωνα με το παράρτημα VΙΙ του παρόντος διατάγματος. 2.Η κατάλληλη χρήση ή διάθεση του καταχωρισμένου φυτικού υλικού που αναφέρεται στο άρθρο 6 παράγραφος 2 του παρόντος, υπό τον έλεγχο των αρμοδίων αρχών με την κατάλληλη επικοινωνία μεταξύ τους ώστε να εξασφαλίζεται πάντοτε ο έλεγχος αυτός και με την έγκριση τους στην περίπτωση που συσκευάζονται ή μεταποιούνται οι πατάτες όσον αφορά τις εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων που αναφέρονται στην πρώτη και τη δεύτερη περίπτωση, είναι η ακόλουθη: i) για κονδύλους πατάτας, – χρήση ως πατάτες εμπορίου (ware) με προορισμό την κατανάλωση, συσκευασμένες για άμεση παράδοση και χρήση χωρίς επανασυσκευασία, σε χώρο με κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων. Οι πατάτες που προορίζονται για φύτευση μπορούν να υποβληθούν σε χερισμό στον ίδιο χώρο μόνον, εάν ο χειρισμός αυτός γίνει χωριστά ή μετά από καθαρισμό και απολύμανση, ή– χρήση ως πατάτες εμπορίου (ware) προοριζόμενες για βιομηχανική μεταποίηση, και που προορίζονται για απευθείας και άμεση παράδοση σε μεταποιητική μονάδα με κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων και με σύστημα καθαρισμού και απολύμανσης τουλάχιστον των αναχωρούντων οχημάτων, ή– άλλη χρήση ή διάθεση, με την προϋποθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διάδοσης του οργανισμού και υπό την προϋπόθεση της έγκρισης από τις επίσημες αρχές, ii) για άλλα μέρη φυτών, συμπεριλαμβανομένων υπολειμμάτων βλαστών και φυλλώματος, – καταστροφή ή– άλλη χρήση ή διάθεση, με την προϋποθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος διάδοσης του οργανισμού και υπό την προϋπόθεση της χορήγησης έγκρισης από τις αρμόδιες επίσημες αρχές. 3.Οι κατάλληλες μέθοδοι απολύμανσης των αντικειμένων που αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 3 του παρόντος πρέπει να είναι ο καθαρισμός και, κατά περίπτωση, η απολύμανση, έτσι ώστε να μην υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού και πρέπει να εφαρμόζονται υπό την εποπτεία των αρμόδιων επισήμων αρχών. 4.Η σειρά μέτρων που εφαρμόζουν οι αρμόδιες αρχές εντός των οριοθετημένων ζωνών που καθορίστηκαν σύμφωνα με το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iν) και στοιχείο γ) σημείο iii) και αναφέρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 4, του παρόντος περιλαμβάνει: 4.1. Σε περιπτώσεις όπου οι περιοχές παραγωγής χαρακτηρίζονται ως μολυσμένες βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος: 1)σε αγρό ή μονάδα με προστατευμένες καλλιέργειες που χαρακτηρίζονται ως μολυσμένες βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος είτε i) κατά τη διάρκεια τουλάχιστον τεσσάρων καλλιεργητικών ετών μετά το έτος της προσδιορισθείσας μόλυνσης, - λαμβάνονται μέτρα για την εξάλειψη των αυτοφυών φυτών πατάτας και τομάτας και άλλων ξενιστών του οργανισμού συμπεριλαμβανομένων των ζιζανίων της οικογένειας των σολανωδών και- δεν φυτεύονται τα ακόλουθα: - κόνδυλοι, φυτά ή πραγματικοί σπόροι πατάτας, - φυτά και σπόροι τομάτας, - λαμβάνοντας υπόψη τη βιολογία του οργανισμού, - άλλα φυτά ξενιστές, - φυτά, είδη του γένους Βrassica, στα οποία υπάρχει εμφανής κίνδυνος επιβίωσης του οργανισμού, - καλλιέργειες στις οποίες υπάρχει εμφανής κίνδυνος εξάπλωσης του οργανισμού, - κατά την πρώτη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τομάτας μετά την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούμενη περίπτωση, και υπό την προϋπόθεση ότι ο αγρός έχει βρεθεί ότι είναι απαλλαγμένος από αυτοφυή φυτά τομάτας και πατάτας και άλλα φυτά ξενιστές συμπεριλαμβανομένων των ζιζανίων της οικογένειας των σολανωδών, κατά τη διάρκεια επίσημων επιθεωρήσεων για δύο τουλάχιστον συνεχή καλλιεργητικά έτη πριν τη φύτευση, - στην περίπτωση της πατάτας, επιτρέπεται μόνον η παραγωγή πατάτας εμπορίου (ware), - στην περίπτωση πατάτας και τομάτας, οι συγκομισθέντες κόνδυλοι πατάτας ή τα φυτά τομάτας, ανάλογα, εξετάζονται, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο παράρτημα ΙΙ, - κατά την πρώτη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τομάτας μετά την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούμενη περίπτωση και σύμφωνα με ένα κατάλληλο σύστημα αμειψισποράς τουλάχιστον δύο ετών εάν πρόκειται να καλλιεργηθεί πατατόσπορος, πραγματοποιείται επίσημη επιθεώρηση όπως καθορίζεται στο άρθρο 2 παράγραφος 1 του παρόντος, ήii) κατά τη διάρκεια πέντε καλλιεργητικών ετών μετά την περίοδο της προσδιορισθείσας μόλυνσης, – λαμβάνονται μέτρα για την εξάλειψη των αυτοφυών φυτών πατάτας και τομάτας και άλλων ξενιστών του οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των ζιζανίων της οικογένειας των σολανωδών, και– ο αγρός διατηρείται, κατά τα πρώτα τρία έτη, είτε χέρσος είτε με σιτηρά, ανάλογα με τον προσδιορισθέντα κίνδυνο, είτε ως μόνιμος βοσκότοπος στον οποίο η βλάστηση κόβεται συχνά και χαμηλά ή ο οποίος χρησιμοποιείται για εντατική βόσκηση ή με γρασίδι για σποροπαραγωγή·κατά τα επόμενα δύο έτη φυτεύονται φυτά που δεν είναι ξενιστές του οργανισμού για τα οποία δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος επιβίωσης ή διάδοσης του οργανισμού, – κατά την πρώτη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τομάτας μετά την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούμενη περίπτωση, και υπό την προϋπόθεση ότι ο αγρός είναι απαλλαγμένος από αυτοφυή φυτά τομάτας και πατάτας και άλλα φυτά ξενιστές συμπεριλαμβανομένων των ζιζανίων της οικογένειας των σολανωδών, πρέπει για δύο τουλάχιστον συνεχή καλλιεργητικά έτη πριν τη φύτευση, - στην περίπτωση της πατάτας, επιτρέπεται η παραγωγή πατατόσπορου ή πατάτας εμπορίου (ware), - οι συγκομισθέντες κόνδυλοι πατάτας ή τα φυτά τομάτας, ανάλογα, εξετάζονται, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο παράρτημα ΙΙ· 2)σε όλους τους άλλους αγρούς της μολυσμένης περιοχής παραγωγής και εφόσον οι αρμόδιες υπηρεσίες κρίνουν ότι έχει εξαλειφθεί ο κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού από αυτοφυή φυτά πατάτας ή τομάτας ή άλλα αυτοφυή φυτά που βρέθηκαν να είναι ξενιστές του οργανισμού συμπεριλαμβανομένων των σολανωδών ζιζανίων ανάλογα: - το καλλιεργητικό έτος μετά την προσδιορισθείσα μόλυνση: - είτε δεν φυτεύονται κόνδυλοι, φυτά ή πραγματικοί σπόροι πατάτας ή άλλα φυτά που είναι ξενιστές του οργανισμού, ή- στην περίπτωση των κονδύλων πατάτας, είναι δυνατόν να φυτευθεί πιστοποιημένος πατατόσπορος για παραγωγή πατάτας εμπορίου (ware) μόνον, - στην περίπτωση των φυτών τομάτας, είναι δυνατόν να φυτευθούν φυτά τομάτας που καλλιεργούνται από σπόρο που πληροί τις απαιτήσεις του π.δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει, για παραγωγή καρπών μόνον, - το δεύτερο καλλιεργητικό έτος μετά την προσδιορισθείσα μόλυνση: - στην περίπτωση της πατάτας, για παραγωγή πατατόσπορου ή πατάτας εμπορίου (ware), φυτεύεται μόνον πιστοποιημένος πατατόσπορος ή πατατόσπορος που έχει υποβληθεί σε επίσημο έλεγχο για την απουσία της καστανής σήψης και έχει καλλιεργηθεί υπό επίσημο έλεγχο σε διαφορετικούς χώρους παραγωγής από αυτούς που αναφέρονται στο σημείο 4.1, - στην περίπτωση της τομάτας, για παραγωγή φυτών ή καρπών, φυτεύονται μόνον φυτά τομάτας που καλλιεργούνται από σπόρο που πληροί τις απαιτήσεις του π.δ. 365/2000 (Α΄307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει ή, στην περίπτωση καλλιεργειών που πολλαπλασιάζονται βλαστητικά, από φυτά τομάτας που παράγονται από τέτοιου είδους σπόρο και καλλιεργούνται υπό επίσημο έλεγχο σε τόπους παραγωγής εκτός από αυτούς που αναφέρονται στο σημείο 4.1, - τουλάχιστον για το τρίτο καλλιεργητικό έτος μετά την προσδιορισθείσα μόλυνση, - στην περίπτωση της πατάτας, φυτεύεται μόνον πιστοποιημένος πατατόσπορος ή πατατόσπορος που έχει παραχθεί υπό επίσημο έλεγχο από πιστοποιημένο πατατόσπορο για παραγωγή είτε πατατόσπορου είτε πατάτας εμπορίου (ware), - στην περίπτωση της τομάτας, φυτεύονται για παραγωγή φυτών ή καρπών μόνον φυτά τομάτας που καλλιεργούνται από σπόρο που πληροί τις απαιτήσεις του π.δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει ή φυτά τομάτας που καλλιεγούνται υπό επίσημο έλεγχο και από τέτοιου είδους φυτά· - κατά τη διάρκεια όλων των καλλιεργητικών ετών που αναφέρονται στις προηγούμενες περιπτώσεις, λαμβάνονται μέτρα για την εξάλειψη των αυτοφυών φυτών πατάτας και άλλων αυτοφυών φυτών που βρέθηκαν να είναι ξενιστές του οργανισμού, εάν υπάρχουν, και διενεργείται επίσημος έλεγχος των καλλιεργούμενων φυτών σε κατάλληλες χρονικές περιόδους και, σε κάθε αγρό καλλιέργειας πατάτας, διενεργείται επίσημος έλεγχος όσον αφορά τις συγκομισθείσες πατάτες σύμφωνα με τη διαδικασία του παραρτήματος ΙΙ· 3)αμέσως μετά το χαρακτηρισμό μόλυνσης σύμφωνα με το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος και μετά το πρώτο επόμενο καλλιεργητικό έτος: - καθαρίζονται και, κατά περίπτωση, απολυμαίνονται κατάλληλα όλα τα μηχανήματα και οι αποθηκευτικοί χώροι του τόπου παραγωγής που έχουν σχέση με την παραγωγή πατάτας και τομάτας, με τις κατάλληλες μεθόδους, όπως ορίζεται στο σημείο 3, - εφαρμόζονται επίσημοι έλεγχοι των προγραμμάτων άρδευσης και ψεκασμού από τις αρμόδιες υπηρεσίες, συμπεριλαμβανομένης της απαγόρευσης αυτών, όπου ενδείκνυται, προκειμένου να παρεμποδιστεί η διάδοση του οργανισμού· 4)στις μονάδες προστατευμένης παραγωγής που έχουν χαρακτηρισθεί ως μολυσμένες, βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο ii) του παρόντος όπου είναι δυνατή η πλήρης αντικατάσταση του υποστρώματος βλάστησης, - δεν φυτεύονται κόνδυλοι, φυτά ή πραγματικοί σπόροι πατάτας ή άλλοι ξενιστές του οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των φυτών και σπόρων τομάτας, παρά μόνο εάν στη μονάδα παραγωγής εφαρμόζονται επισήμως εποπτευόμενα μέτρα για την εξάλειψη του οργανισμού και την απομάκρυνση του υλικού όλων των ξενιστών, συμπεριλαμβανομένων, τουλάχιστον, της πλήρους αντικατάστασης του υποστρώματος βλάστησης και του καθαρισμού και, κατά περίπτωση, της απολύμανσης της μονάδας παραγωγής και όλου του εξοπλισμού, και, στη συνέχεια έχει χορηγηθεί άδεια για παραγωγή πατάτας ή τομάτας από τις αρμόδιες αρχές, και- για παραγωγή πατάτας, η παραγωγή αυτή γίνεται από πιστοποιημένο πατατόσπορο ή από μικροκονδύλους ή μικροφυτά που προέρχονται από ελεγμένες πηγές, - για παραγωγή τομάτας,η παραγωγή αυτή γίνεται από σπόρο που πληροί τις απαιτήσεις του Π.Δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει ή, στην περίπτωση καλλιεργειών που πολλαπλασιάζονται βλαστητικά, από φυτά τομάτας που παράγονται από τέτοιου είδους σπόρο και καλλιεργούνται υπό επίσημο έλεγχο, - εφαρμόζονται κατάλληλοι επίσημοι έλεγχοι των προγραμμάτων άρδευσης και ψεκασμού, συμπεριλαμβανομένης της απαγόρευσης αυτών, προκειμένου να αποφευχθεί η διάδοση του οργανισμού· 4.2. Εντός της οριοθετημένης ζώνης, με την επιφύλαξη των μέτρων που περιγράφονται στο σημείο 4.1, οι αρμόδιες επίσημες αρχές με ελέγχους που διενεργούν: 1)αμέσως μετά την προσδιορισθείσα μόλυνση, εξασφαλίζεται ότι καθαρίζονται και απολυμαίνονται κατάλληλα όλα τα μηχανήματα και οι αποθηκευτικοί χώροι σε τέτοιες εγκαταστάσεις που εμπλέκονται στην παραγωγή πατάτας ή τομάτας, με τις κατάλληλες μεθόδους όπως ορίζεται στο σημείο 3· 2)αμέσως, και για τρεις τουλάχιστον καλλιεργητικές περιόδους μετά την προσδιορισθείσα μόλυνση: 1) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες η οριοθετημένη ζώνη έχει προσδιοριστεί βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iν) του παρόντος, – διασφαλίζουν την εποπτεία των χώρων όπου καλλιεργούνται, αποθηκεύονται ή διακινούνται κόνδυλοι πατάτας ή τομάτες, καθώς και των χώρων στους οποίους λειτουργούν, βάσει σύμβασης, μηχανήματα για την παραγωγή πατάτας ή τομάτας, – απαιτούν τη φύτευση αποκλειστικά πιστοποιημένου πατατόσπορου ή πατατόσπορου που έχει παραχθεί υπό επίσημο έλεγχο για όλες τις καλλιέργειες πατάτας της ζώνης αυτής, και δοκιμή, μετά τη συγκομιδή, του πατατόσπορου που παράγεται σε τόπους παραγωγής που έχουν χαρακτηριστεί ως πιθανώς μολυσμένοι, σύμφωνα με το άρθρο 5 παράγραφος 1 στοιχείο α) σημείο iii) του παρόντος, – απαιτούν τη χωριστή διαχείριση των αποθεμάτων συγκομισθέντος πατατόσπορου και πατάτας εμπορίου για όλες τις εγκαταστάσεις της ζώνης ή ένα σύστημα καθαρισμού και, όπου ενδείκνυται, απολύμανσης που θα πρέπει να εφαρμοσθεί μεταξύ της διαχείρισης των αποθεμάτων πατατόσπορου και πατάτας εμπορίου (ware), – απαιτούν τη φύτευση μόνον φυτών τομάτας που αναπτύσσονται από σπόρο που πληροί τις απαιτήσεις του Π.Δ. 365/2000 (Α΄ 307) όπως έχει τροποποιηθεί και ισχύει ή, στην περίπτωση καλλιεργειών που πολλαπλασιάζονται βλαστητικά, από φυτά τομάτας που παράγονται από τέτοιου είδους σπόρο και καλλιεργούνται υπό επίσημο έλεγχο, για όλες τις καλλιέργειες τομάτας της ζώνης αυτής, – διενεργούν επίσημη επισκόπηση (surνey), όπως περιγράφεται στο άρθρο 2 παράγραφος 1 του παρόντος, 2) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το επιφανειακό νερό έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο γ) σημείο ii) του παρόντος ή περιλαμβάνεται στα στοιχεία για πιθανή διάδοση του οργανισμού, σύμφωνα με το παράρτημα V σημείο 2 του παρόντος διατάγματος, – διενεργείται ετήσια επισκόπηση (surνey) την κατάλληλη στιγμή, συμπεριλαμβανομένης της δειγματοληψίας του επιφανειακού νερού και, ενδεχομένως, των κατάλληλων ξενιστών της οικογένειας των σολανωδών στις σχετικές πηγές επιφανειακού νερού, και δοκιμές σύμφωνα με τις σχετικές μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα ΙΙ για το αναφερόμενο φυτικό υλικό και άλλες περιπτώσεις, – εφαρμόζονται επίσημοι έλεγχοι στα προγράμματα άρδευσης και ψεκασμού, συμπεριλαμβανομένης της απαγόρευσης χρήσης του νερού που έχει χαρακτηρισθεί ως μολυσμένο για την άρδευση και τον ψεκασμό του καταχωρισμένου φυτικού υλικού, και, κατά περίπτωση, άλλων ξενιστών προκειμένου να αποφευχθεί η διάδοση του οργανισμού. Η απαγόρευση αυτή μπορεί να επανεξετάζεται βάσει των αποτελεσμάτων της προαναφερόμενης ετήσιας επισκόπησης (surνey) και οι χαρακτηρισμοί ανακαλούνται στις περιπτώσεις που οι αρμόδιες επίσημες αρχές θεωρούν ότι το επιφανειακό νερό δεν είναι πλέον μολυσμένο. Είναι δυνατόν να επιτραπεί η χρήση νερού που τελεί υπό απαγόρευση, υπό την προϋπόθεση επίσημου ελέγχου, για άρδευση και ψεκασμό των φυτών ξενιστών, στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται επισήμως εγκεκριμένες τεχνικές για την εξάλειψη του οργανισμού και την πρόληψη της μετάδοσής του, – στις περιπτώσεις κατά τις οποίες οι απορρίψεις υγρών αποβλήτων είναι μολυσμένες, εφαρμόζονται επίσημοι έλεγχοι για τη διάθεση των στερεών αποβλήτων ή των απορρίψεων υγρών αποβλήτων από εγκαταστάσεις βιομηχανικής μεταποίησης ή συσκευασίας του αναφερόμενου φυτικού υλικού· 3)καταρτίζεται, όπου ενδείκνυται, πρόγραμμα αντικατάστασης όλων των αποθεμάτων πατατόσπορου σε εύθετο χρονικό διάστημα. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VΙΙ Οι επίσημα εγκεκριμένες μέθοδοι διάθεσης αποβλήτων που αναφέρονται στο παράρτημα VΙ παράγραφος 1 του παρόντος διατάγματος είναι σύμφωνες με τις ακόλουθες διατάξεις έτσι ώστε να αποτραπεί οιοσδήποτε εμφανής κίνδυνος διάδοσης του οργανισμού: i) τα απόβλητα πατάτας και τομάτας (συμπεριλαμβανομένων των απορρίψεων πατατών και του φλοιού πατάτας) και οποιοδήποτε άλλο στερεό απόβλητο που προέρχεται από πατάτες και τομάτες (συμπεριλαμβανομένου του χώματος, των πετρών και άλλων υπολειμμάτων) πρέπει να απομακρύνονται, με : - διάθεση σε επισήμως εγκεκριμένο και ειδικό χώρο διάθεσης αποβλήτων όπου δεν υφίσταται εμφανής κίνδυνος διαφυγής του οργανισμού στο περιβάλλον, π.χ. μέσω της διήθησης σε γεωργικά εδάφη ή της επαφής με πηγές υδάτων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για άρδευση γεωργικών εδαφών. Τα απόβλητα μεταφέρονται απευθείας στον εν λόγω χώρο υπό συνθήκες περιορισμού, έτσι ώστε να μην υπάρχει κίνδυνος απώλειας των αποβλήτων, ή- καύση, ή- άλλα μέτρα, με την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής κίνδυνος μετάδοσης του οργανισμού· τα μέτρα αυτά πρέπει να κοινοποιούνται από τη Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων στην Επιτροπή και τα άλλα κράτη μέλη. ii) υγρά απόβλητα: πριν από τη διάθεσή τους, τα υγρά απόβλητα που περιλαμβάνουν αιωρούμενα στερεά στοιχεία υποβάλλονται σε διαδικασίες διήθησης ή καθίζησης για την απομάκρυνση αυτών των στερεών στοιχείων. Η διάθεση των στερεών αυτών στοιχείων γίνεται με τους τρόπους που προβλέπονται στο σημείο i). Τα υγρά απόβλητα πρέπει είτε: - να θερμαίνονται τουλάχιστον σε 60 ΊC καθ’ όλο τον όγκο επί τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη διάθεσή τους ή- να διατίθενται με άλλο τρόπο που έχει εγκριθεί επισήμως και υπό επίσημο έλεγχο, ώστε να μην υπάρχει εμφανής κίνδυνος επαφής των αποβλήτων με γεωργικά εδάφη ή πηγές νερού που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για άρδευση γεωργικών εδαφών. Οι λεπτομέρειες των μέτρων αυτών κοινοποιούνται από τη Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων στα άλλα κράτη μέλη και την Επιτροπή. Οι επιλογές που παρατίθενται στο παρόν παράρτημα ισχύουν επίσης για τα απόβλητα που έχουν σχέση με τη διαχείριση, διάθεση και επεξεργασία μολυσμένων παρτίδων.»
Άρθρο 3
1.  
    Μετά το άρθρο 10 του π.δ. 255/2000 (Α΄ 214) προστίθενται νέο άρθρο 10α που έχει ως εξής : 10α Με Απόφαση του Υπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων που δημοσιεύεται στην Εφημερίδα της Κυβερνήσεως, μετά από εισήγηση της Διεύθυνσης Προστασίας Φυτικής Παραγωγής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, μπορούν να ρυθμίζονται ειδικά και τεχνικά θέματα καθώς και κάθε λεπτομέρεια για την εφαρμογή του παρόντος διατάγματος, συμπεριλαμβανομένων και των παραρτημάτων αυτού.
Άρθρο 4 "(άρθρο 2 Οδηγίας 2006 / 63 /ΕΚ)Έναρξη ισχύος"
1.  
    Το παρόν Προεδρικό Διάταγμα ισχύει από την 1η Απριλίου 2007. Στον Υφυπουργό Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων αναθέτουμε τη δημοσίευση και εκτέλεση του παρόντος διατάγματος.
  • Τις διατάξεις α) Του άρθρου 1 παρ. 1, 2 και 3 του ν.1338/1983 «Εφαρμογή του Κοινοτικού Δικαίου» (Α΄ 34) όπως η παρ. 1 έχει τροποποιηθεί με τη διάταξη του άρθρου 6 παρ. 1 του ν.1440/1984 «Συμμετοχή της Ελλάδος στο κεφάλαιο, στα αποθεματικά και στις προβλέψεις της Ευρωπαϊκής Τράπεζας Επενδύσεων, στο κεφάλαιο της Ευρωπαϊκής Κοινότητος, Άνθρακος και Χάλυβος και του Οργανισμού Εφοδιασμού ΕURΑΤΟΜ» (Α΄ 70) και του άρθρου 3 του ιδίου ν. 1338/1983, όπως αυτό έχει αντικατασταθεί με το άρθρο 65 του ν. 1892/90 (Α΄ 101). β) Του άρθρου 4 του ν.2147/1952 (Α΄ 155) «Περί προλήψεως και καταστολής των ασθενειών και εχθρών των φυτών και περί οργανώσεως της Φυτοπαθολογικής Υπηρεσίας». γ) Του άρθρου 90 του Κώδικα Νομοθεσίας για την Κυβέρνηση και τα Κυβερνητικά όργανα που τέθηκε σε ισχύ με το άρθρο του υπ΄ αριθμ. 63/2005 προεδρικού διατάγματος (Α΄ 98).
  • Την υπ’ αριθμ. Υ 132/11.10.2004 (Β΄ 1533) κοινή απόφαση του Πρωθυπουργού και του Υπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων «Ανάθεση αρμοδιοτήτων στον Υφυπουργό Αγροτικής Ανάπτυξης Αλέξανδρο Κοντό
  • Το γεγονός ότι από τις διατάξεις του παρόντος διατάγματος δεν προκαλείται δαπάνη σε βάρος του Κρατικού Προϋπολογισμού.
  • Την υπ’ αριθμ. 78/2007 γνωμοδότηση του Συμβουλίου της Επικρατείας μετά από πρόταση του Υπουργού Οικονομίας και Οικονομικών και του Υφυπουργού Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων,
Τίτλος Κωδικός Ημερομηνία
ΠΡΑΞΗ 2005/63 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 2005/63 2005
ΑΠΟΦΑΣΗ 2004/132 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 2004/132 2004
ΝΟΜΟΣ 1952/2147 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 1952/2147 1952
ΝΟΜΟΣ 1983/1338 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 1983/1338 1983
ΝΟΜΟΣ 1984/1440 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 1984/1440 1984
ΝΟΜΟΣ 1990/1892 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 1990/1892 1990
ΠΡΟΕΔΡΙΚΟ ΔΙΑΤΑΓΜΑ 2000/255 (ΑΓΝΩΣΤΟΣ ΤΙΤΛΟΣ) 2000/255 2000
Τίτλος Κωδικός Ημερομηνία